禽源多克隆抗體制備技術(shù)的建立及其初步應(yīng)用.pdf

1、小鼠單克隆抗體技術(shù)已成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域不可或缺的研究工具，在疾病的診斷和治療領(lǐng)域也得到廣泛應(yīng)用。然而，由于小鼠自身免疫系統(tǒng)的局限，某些抗原或表位，特別是同為哺乳動(dòng)物的人體抗原在小鼠體內(nèi)可能因?yàn)榉N屬相近而不易產(chǎn)生好的免疫應(yīng)答，給制備相應(yīng)的小鼠單克隆抗體造成一定的困難。因此，有必要基于其它種屬動(dòng)物開發(fā)新的抗體制備技術(shù)。禽源抗體技術(shù)也稱卵黃抗體技術(shù)（簡稱IgY技術(shù)），是用免疫原刺激禽類動(dòng)物，產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體，該抗體會(huì)轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存在卵黃中，經(jīng)特

2、殊的提取技術(shù)，可從卵黃中獲得大量特異性的多克隆抗體的一種抗體制備技術(shù)。相較于哺乳動(dòng)物的IgG抗體，禽源IgY抗體的優(yōu)點(diǎn)有:1)減少對(duì)動(dòng)物的傷害，符合日漸嚴(yán)格的動(dòng)物倫理要求;2）飼養(yǎng)成本低，抗體產(chǎn)量高;3）缺少與風(fēng)濕因子反應(yīng)的Fc結(jié)合位點(diǎn)，不會(huì)與血清中的C-反應(yīng)蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，有助于提高血清檢測的特異性;4）不能激活哺乳動(dòng)物的補(bǔ)體系統(tǒng)，有助于降低補(bǔ)體活性檢測中的干擾現(xiàn)象;5）不能結(jié)合細(xì)菌及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面Fc受體，可應(yīng)用于雙重免疫組化檢

3、測;6）與哺乳動(dòng)物種屬系統(tǒng)發(fā)生距離較遠(yuǎn)，有助于制備哺乳類抗原的免疫血清等。本論文的目的是，通過摸索各實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)的實(shí)驗(yàn)參數(shù)及條件，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)建立起一個(gè)有效的禽源多克隆抗體制備技術(shù)平臺(tái)，并應(yīng)用該禽源抗體技術(shù)制備HIV病毒衣殼蛋白(P24)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的特異性IgY多克隆抗體，并比較評(píng)估禽源IgY多克隆抗體在HIV免疫診斷試劑及NSE免疫診斷試劑研發(fā)應(yīng)用的潛能。
　　首先，通過文獻(xiàn)查閱并結(jié)合實(shí)際條件，選取海蘭褐蛋雞作為

4、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并進(jìn)一步摸索實(shí)驗(yàn)雞的飼養(yǎng)條件、免疫方式、禽蛋收集、抗體制備、抗體保藏等條件參數(shù)，初步建立禽源多克隆抗體制備技術(shù)平臺(tái)。結(jié)果如下:(1)實(shí)驗(yàn)雞的飼養(yǎng):實(shí)驗(yàn)室條件下，籠養(yǎng)海蘭褐蛋雞是比較合適的，其次要注意不同生長期海蘭褐蛋雞對(duì)適宜的溫度、濕度、光照、營養(yǎng)等方面的需求，尤其重要的是在海蘭褐生長后期需要大量儲(chǔ)備鈣質(zhì)以保證產(chǎn)蛋期的產(chǎn)蛋質(zhì)量;實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)條件下，海蘭褐蛋雞開始產(chǎn)蛋的日齡是154天，與養(yǎng)雞場中飼養(yǎng)的蛋雞保持一致;且在產(chǎn)蛋高峰期，

5、實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)的海蘭褐蛋雞的周產(chǎn)蛋率能夠達(dá)到95％;(2)實(shí)驗(yàn)雞的免疫:選用弗氏佐劑，以500ug/只的劑量，皮下與肌肉混合多點(diǎn)免疫，間隔周期14天的免疫方案;通過該免疫方案，能夠獲得滴度在105以上的免疫血清;(3)禽蛋的收集:將不同時(shí)期產(chǎn)下的含有特異性抗體的雞蛋標(biāo)記后保藏在4℃條件下;(5)雞源IgY抗體的純化:通過多種純化方法的比較，最終確定以PEG6000梯度純化來獲得純度較高、活性較好的抗體;用PEG6000梯度沉淀純化方法

6、進(jìn)行IgY抗體制備，平均每個(gè)卵黃可以獲得約50 mg的抗體;(5)抗體穩(wěn)定性分析:根據(jù)抗體活性變化確定IgY抗體的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性等;實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溫度低于70℃的條件下，IgY抗體的活性相對(duì)穩(wěn)定;當(dāng)環(huán)境中的pH在4.0-11.0范圍內(nèi)，IgY抗體的活性還是比較穩(wěn)定的;在4℃和-20℃條件下，IgY抗體能夠長期保存。
　　P24抗原檢測是HIV早期輔助診斷的方法，它要求檢測具有高靈敏度（可以檢測到Pg級(jí)別的抗原）、低漏檢率（對(duì)

7、全部亞型的P24抗原均可以有效檢出）、高特異性（減少樣品帶來的非特異性）。目前的診斷試劑仍無法完全滿足臨床檢測的要求，因此我們希望應(yīng)用IgY抗體技術(shù)來制備P24特異性IgY抗體，期望能夠提高檢測的特異性。腫瘤標(biāo)志物的檢測是腫瘤早期診斷的一種有效方式，而腫瘤標(biāo)志物的抗體是建立腫瘤診斷試劑的關(guān)鍵活性原料。由于腫瘤標(biāo)志物多數(shù)是人源的，與哺乳動(dòng)物具有一定的親緣性，因此在大小鼠平臺(tái)制備腫瘤標(biāo)志物抗體有一定的難度。所以，我們希望能夠運(yùn)用IgY抗體技

8、術(shù)來制備腫瘤標(biāo)志物的特異性抗體。
　　其次，應(yīng)用禽源多克隆抗體技術(shù)平臺(tái)來制備特異性的抗HIV-1衣殼蛋白(P24)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)等的IgY多克隆抗體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:(1)用重組蛋白rP24分別免疫小鼠、大鼠、雞和兔子等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)四種動(dòng)物均可對(duì)P24抗原產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng);純化獲得抗rP24的IgY抗體（單個(gè)卵黃中獲取60mg的IgY抗體），與特異性抗rP24的小鼠抗體H5F4、大鼠抗體R15A2進(jìn)行抗體配對(duì)，

9、并分析該配對(duì)與兩個(gè)較佳的P24檢測小鼠抗體配對(duì)H5F4-m9E8及P24大小鼠抗體配對(duì)RI5A2-m9E8檢測P24抗原的性能。結(jié)果顯示，IgY可與P24小鼠抗體H5F4及大鼠抗體R15A2形成較好的P24抗原檢測配對(duì)，夾心法ELISA的檢測下限是1ng/ml，且能夠檢出多數(shù)不同亞型的P24抗原，具有成為HIV診斷試劑候選抗體原料的潛能。(2)用神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE重組蛋白）對(duì)小鼠、大鼠、雞等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行免疫，發(fā)現(xiàn)NSE在雞體內(nèi)

10、的免疫效價(jià)比小鼠和大鼠體內(nèi)的效價(jià)高10倍。同時(shí)，純化獲得的IgY抗體標(biāo)記磁珠后作為捕獲抗體，與標(biāo)記吖啶酯的對(duì)照抗體9601作為報(bào)告抗體形成的免疫化學(xué)發(fā)光檢測配對(duì)，對(duì)重組抗原rNSE具有很好檢測線性(R2=0.999)，檢測靈敏度是0.1-500ng/ml。但是在NSE天然抗原的檢測上，IgY-9601檢測配對(duì)存在檢測值較低且與背景檢測值線性相關(guān)性較一般(R2=0.6097)等問題，有待進(jìn)一步的條件優(yōu)化。
　　總之，本研究初步建立了