ZBTB8A多克隆抗體制備及其相關(guān)信息的初步研究.pdf

1、由于ZBTB家族成員主要表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過BTB結(jié)構(gòu)域和ZNF結(jié)構(gòu)域介導的蛋白與蛋白之間的互作及蛋白與特異性堿基序列的結(jié)合從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性，進而影響細胞的增殖、分化、遷移、凋亡和細胞周期等重要的生理功能。目前關(guān)于ZBTB8A功能研究的報道很少，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫查閱人ZBTB8A相關(guān)信息設計相應的引物，通過RT-PCR從胃癌細胞系AGS中克隆到人ZBTB8A基因，測序證實其為目的基因，構(gòu)建ZBTB8A全長及其截短的不同重組質(zhì)

2、粒，為后續(xù)實驗做準備。
　　 使用ZBTB8A全長及其截短的GFP融合表達載體來探索其在亞細胞水平上的分布情況，亞細胞定位顯示:GFP呈全細胞分布;GFP-ZBTB8A融合蛋白位于細胞核且呈斑點狀分布;GFP-ZBTB8A-BTB融合蛋白顯示核周斑點狀分布，GFP-ZBTB8A-ZNF融合蛋白呈細胞核均勻分布。這些結(jié)果表明，ZBTB8A蛋白是一個轉(zhuǎn)錄因子存在于核內(nèi)，其中這兩個結(jié)構(gòu)域在斑點狀分布中均起著重要的作用，這可能與它們自身

3、結(jié)構(gòu)域的功能相關(guān)。
　　 為了探討ZBTB8A可能參與調(diào)控的細胞信號通路，采用雙熒光素酶檢測試劑盒來檢測ZBTB8A對相關(guān)信號通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。雙熒光素酶實驗顯示:ZBTB8A蛋白抑制多個細胞信號通路活性，特別對pCRE-Luc具有顯著的抑制效應并表現(xiàn)為劑量依賴性。這說明ZBTB8A蛋白在某些功能方面可能作為一個轉(zhuǎn)錄抑制因子，參與多個細胞信號通路活性的調(diào)控，進而影響細胞的增殖、分化、凋亡、遷移和細胞周期等重要的生理過程。

4、>　　 將原核表達載體pGEX-4T-1-ZBTB8A轉(zhuǎn)化到BL21宿主菌，當菌體生長至對數(shù)期，加入終濃度為0.6mMIPTG誘導5小時，將誘導的菌體裂解液經(jīng)SDS-PAGE電泳后，浸泡于0.25MKCl溶液，切下乳白色的目的條帶并切碎，電洗脫和透析，獲得GST-ZBTB8A融合蛋白，免疫印跡實驗進一步證實所純化的蛋白為目的蛋白（抗GST標簽抗體），BCA法測定其濃度為1.254mg/mL，用純化的蛋白多次免疫兔子，獲得相應的免疫血清