β2糖蛋白Ⅰ的純化及其多克隆抗體制備與初步應(yīng)用.pdf

1、目的：獲得高純度人血漿β2糖蛋白Ⅰ(β2GPI)，制備兔抗人β2GPI多克隆抗體，為進(jìn)一步研究β2GPI及其抗體在抗磷脂綜合征(APS)病理機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。 方法：1．采用HClO4沉淀、HeparinSepharoseCL-6B親和層析等方法純化人血漿β2GPI；利用SDS—PAGE電泳、免疫印跡分析提純蛋白的純度；觀察不同溫度、NaCl濃度及防腐劑等條件下的β2GPI穩(wěn)定性。2．以純化的β2GPI作為抗原免疫新西蘭大白

2、兔，獲得抗血清；進(jìn)而利用ProteinA及β2GPI親和層析柱純化抗血清中的總IgG及抗β2GPI抗體；采用免疫雙向擴(kuò)散試驗(yàn)(IDD)、ELISA和免疫印跡等方法進(jìn)行抗體驗(yàn)證。3．應(yīng)用人β2GPI及其多克隆抗體共同刺激單核細(xì)胞株THP-1，檢測其組織因子(TF)活性表達(dá)情況；利用β2GPI親和層析柱，初步分析β2GPI與單核細(xì)胞株THP-1表面膜聯(lián)蛋白A2(AnnexinA2)的結(jié)合情況。 結(jié)果：1．本法獲得了高純度目的蛋白β2

3、GPI(＞95％)。β2GPI在低于0.8mol/LNaCl溶液中室溫及4℃保存易降解變性，但在1.6mol/LNaCl溶液中室溫及4℃保存60天均未見蛋白明顯降解。2．IDD及ELISA鑒定抗血清及總IgG效價(jià)分別達(dá)到1：16和1：100000；免疫印跡顯示純化的總IgG和抗β2GPI抗體與β2GPI蛋白均有特異反應(yīng)條帶；3．β2GPI及其多克隆抗體形成的復(fù)合物能夠刺激單核細(xì)胞株THP-1表達(dá)TF活性；免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，來自THP-1

4、細(xì)胞的AnnexinA2能夠與β2GPI親和柱結(jié)合。 結(jié)論：1．通過本研究，簡單方便地獲得了高純度人血漿β2GPI；在使用和保存β2GPI時(shí)要考慮到其降解的可能性，注意保存條件，必要時(shí)凍干保存。2．通過免疫動(dòng)物及親和層析方法，成功獲得了兔抗人β2GPI多克隆抗體。3．應(yīng)用制備的β2GPI親和層析柱，證明了β2GPI可以結(jié)合單核細(xì)胞株THP-1表面的AnnexinA2；β2GPI與其抗體復(fù)合物能夠刺激THP-1細(xì)胞表達(dá)TF活性，是