人ZHX2多克隆抗體的制備與應(yīng)用.pdf

1、山東大學(xué)碩士學(xué)位論文人ZHX2多克隆抗體的制備與應(yīng)用姓名：史偉申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：醫(yī)學(xué)免疫學(xué)指導(dǎo)教師：馬春紅20090518山東大學(xué)碩士學(xué)位論文采血法采血，利用飽和硫酸銨法對(duì)兔血清中的免疫球蛋白進(jìn)行粗提，分裝后80℃保存，兩種ZHX2GST融合蛋白免疫后血清分別標(biāo)記為ZHX2(1837AA)pAb和ZHX2(263—497AA)pAb。3抗體特異性檢測(cè)利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的ZHX2真核表達(dá)載體pcDNA3ZHX2HA及空載體pcDNA3

2、分別轉(zhuǎn)染HepG2。48h后收集細(xì)胞，并分別利用上述制備的兩種多克隆抗體和商品化HA抗體(1：2000稀釋)，進(jìn)行westernblot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)蛋白的表達(dá)。多克隆抗體按照1：100，1：500，1：1000，1：2000，l：4000比例稀釋?zhuān)糜隍?yàn)證該抗體對(duì)抗原識(shí)別的特異性，并確定抗體最適滴度。4抗體應(yīng)用收集肝癌切除術(shù)術(shù)后組織標(biāo)本和不同腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞，SDS裂解液提取組織蛋白及細(xì)胞蛋白，利用自行制備的ZHX

3、2多克隆抗體進(jìn)行Westernblot，檢測(cè)ZHX2在肝癌組織及不同腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平。爭(zhēng)士里：口木1ZHX2融合蛋白在原核細(xì)胞中的表達(dá)11重組質(zhì)粒pGEXZHX2(1_837從)、pGEXZHX2(263—497從)的鑒定重組質(zhì)粒CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，抽提陽(yáng)性重組子質(zhì)粒DNA，經(jīng)BamHI和NotI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)分子量約為2500bp與700bp左右的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。D

4、NA測(cè)序分析及BLAST對(duì)比分析證明，重組載體插入序列正確，pGEXZHX2(1837AA)、pGEXZHX2(263497AA)內(nèi)分別含有編碼ZHX21837位氨基酸及263497位氨基酸的相應(yīng)編碼序列。126STZHX2(卜837從)、GSTZHX2(263—497從)融合蛋白在原核細(xì)胞中的表達(dá)工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)6h后，分別收集菌體及上清，進(jìn)行SDSPAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色顯示：IPTG誘導(dǎo)的陽(yáng)性工程菌菌體蛋白電泳后在118K