nogo-66多克隆抗體的制備和鑒定

1、· 1 O 6 4·2 0 0 5年 1 0月第 2 8卷第 1 0期 C h i nJL a bMe d． O c t o b e r 2 o 0 5 ． V 0 l2 8． N 0 ． 1 0N o g o 一 6 6多克隆抗體 的制備和鑒定 謝 云崢 于盼盼 劉 東銀 陸佩 華 黃立東． 基 礎(chǔ) 實 驗 診 斷 研 究 ．【 摘要】目的 制備抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)( C N S ) 突起再生抑制因子 N o g o 胞

2、外段 N o g o - 6 6的多克隆 抗體， 以 進(jìn)行 N o g o 分子檢測和功能研究。方法 采用原核系統(tǒng)表達(dá)來源于大鼠的 G S T ． N o g o - 6 6 融合 蛋白， 經(jīng)純化后免疫新西蘭兔制備多克隆抗體， 采用免疫印跡、 免疫組織化學(xué)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對該抗 體的特異性及生物學(xué)活性進(jìn)行鑒定。結(jié)果 獲得 了高效價的 1 ： 1 00 0 0 兔抗大 鼠 N o g o - 6 6多克隆抗 體， 該抗體能夠識別原核表達(dá)的

3、N o g o 分子， 大鼠脊髓切片的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示， N o g o 分子在神 經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞中有廣泛表達(dá) ； 并能阻斷 N o g o 分子對 P C 1 2細(xì)胞突起生長的抑制作用， 具有一定 的生物學(xué)活性 。結(jié)論 制備 了能識別 天然 N o g o 分子 ， 并具 有 良好生 物學(xué)活性 的抗 N o g o - 6 6多克 隆抗 體， 為檢測 N o g o 分子和進(jìn)一步研究其功能提供了有力的工具。【 關(guān)鍵詞】 神經(jīng)再

4、生； 抗體 ， 多克??； 抗體， 特異性 ； N o g o - 6 6P r e pa r a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fNo g o - 6 6p o l y c l o n a la n t i b o d i e sXI E Y u n - z h e n g ， Y U P a n - p a n，L I UD o n g — y i n ， L UP e i —

5、h u a ， H U A N GL i — d o n g ． D e p a r t m e n to f N e u r o b i o l o g y ， S h a n g h a iS e c o n dMe d i c a lU n i v e r s i t y ，S h a n g h a i2 0 0 0 2 5，C h i n aC o r r e s p o n d i n ga u t h o r ．HU AN

6、GL i — Do n g，Ema i l ： p t h u a n g l i d o n g @ y a h o o ． c o r n． c n【 A b s t r a c t 】O b j e c t i v eT op r e p a r ep o l y c l o n a la n t i b o d i e so fa n t iN o g o - 6 6 ， t h ee x t r a c e l l u l a

7、 rr e g i o no fo n ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e m n e u r it er e g e n e r a t i o ni n h i b i t o rNo g o ，wh i c hc o u l db eu s e dt of u r t h e ri d e n t i f i c a t i o na n df u n c t i o n a l s t

8、u d yo fN o g omo l e c u l e ． M e t h o d sP r e p a r i n gr a b b i ta n t ir a tN o g o - 6 6p o l y c l o n a la n t i b o d i e sw i t hap u r i f i e dNo g o - 6 6f u s i o np r o t e i ne x p r e s s e di nE ． c

9、 o l is y s t e m． S t u d y i n gi t ss p e c i f i c i t yb yW e s t e r n — b l o ta ndi mm u n o — h i s t o c h e mi c a lt e c h n i q u e sa n di d e n t i f y i n gi t sb i o l o g ic a la c t i v i t yi nP C 1 2

10、c e l l s ． Re s u l t sT h eh i g ht i t e r( 1 ： 1 00 0 0)a nt ir a tN o g o - 6 6p o l y c l o n a la n t i b o d i e sw e r eo b t a i n e d ． T h i sa n t i b o d yc o u l ds p e c i f i c a l l vr e c o g n i z et

11、h eN o g op r o t e i ne x p r e s s e di nE． c o l is y s t e m． I mmu n o — h i s t o c h e mi c a ls t a i n i n gi n d i c a t e dt h a tt h eN o g ow a swi d e l ye x p r e s s e di nr a ts p i n a l c o r dn e u r

12、 o n sa n do l i g o d e n d r o c y t e s ． I tc o u l de f f e c t i v e l yb l o c kt h en e u r i t ee x t e n s i o n i n h i b i t i o no fNo g op r o t e i ni nP C1 2 ． Co n c l u s i o nS u c c e s s f u lp r e p

13、 a r a t i o no fa n t ir a tN o g op o l y c l o n a l a n t i b o d i e sp r o v i d e sau s e f u lt o o li ni d e n t i f i c a t i o no rf u r t h e rf u n c t i o n a l s t u d yo fN o g omo l e c u l e ．【 K e yw

14、 o r d s 】N e u r a lr e g e n e r a t i o n ； A n t i b o d y ， p o l y c l o n a l ；A n t i b od y ， s p e c i f i c i t y ；N o g o - 6 6N o g o 是 2 0 0 0年發(fā)現(xiàn)并克隆 出來的一種源于髓 鞘 ， 能夠抑制中樞神經(jīng) 系統(tǒng) ( C N S ) 突起再生的抑制 分子。N o g o 分子有

15、 N o g o ． A 、 N o g o ． B和 N o g o ． C3個 異構(gòu)體 ， 其中 N o g o — A主要在 C N S少突膠質(zhì) 細(xì)胞和 神經(jīng)元中表達(dá) 。在 N o g o 分子 的 2 個跨膜區(qū)之間， 有 一 段 6 6 個氨基酸的環(huán)狀結(jié)構(gòu) ， 稱為 N o g o - 6 6 。該結(jié) 構(gòu)域是 N o g o 分子的活性結(jié)構(gòu)域 ， 能夠引起軸突生長 錐 的塌陷和抑制神經(jīng)突起的生長 _ 1 引。成年 哺乳動 物 C

16、 N S 損傷后很難再生的一個重要原 因是 ， 損傷局 部環(huán)境 中存在抑制神經(jīng)再生的分子 ， N o g o 就是其中基金項 目： 上海市科技發(fā)展基金資助項 目( 0 2 J C 1 4 0 1 4 )作者單位： 2 0 0 0 2 5上海 ， 第二醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)實驗室( 謝云 崢 、 于盼 盼同為第一作者 )通訊作者 ： 黃立東 ， 電子信箱 ： p t h u a n g l i d o n g @y a h o o ． c o

17、 m ． c n的一個主要成員 。本實驗采用在大腸桿菌系統(tǒng)中表 達(dá) 的 G S T — N o g o - 6 6融合蛋 白作為 免疫原 ， 制備 了兔 抗大 鼠 N o g o - 6 6的多克 隆抗體 ， 為進(jìn)一步研 究 N o g o分子的功能及研究脊髓損傷后 的修復(fù)和再生提供重 要工具 。材料 和 方法 一、材 料 1 ． 實驗動物 ： 健康雄 性新 西 蘭兔 3只 ( 約 1 ． 8k g ／ 只) ， 雌性 s D大 鼠 4

18、只 ( 約 2 5 0 g ／ 只 ) ， 由本校實 驗動物 中心提供 。2 ． 質(zhì) 粒 與菌 種 ： 含 大 鼠 N o g o - 6 6基 因 的 質(zhì)粒 p G E X — K G — N o g o - 6 6 和 p M A L — C 2 X — N o g o - 6 6由本 室構(gòu) 建保存 ， 表達(dá)載體 p E T 一 2 8 a ( +) ( N o v a g e n 公司 ) ， 大 維普資訊 http://www.

19、cqvip.com · 1 0 6 6·中華 檢驗 醫(yī)學(xué)雜志 2 0 0 5 年 1 0月第 2 8 卷第 1 0 期 C h i nJL a bM e d ， O c t o b e r 2 0 0 5 ， V o l2 8 ， N o ． 1 0M B PNo g o 6 6M： 蛋 白質(zhì)分 子量； 5 0 0 。 。 ～ 1 0 0 0 ～： 抗 體稀釋度 ； P r e ． i m m u ： 免疫 前血清對

20、照 圖2 純化 G S T ． N o g o - 6 6多抗的 W B圖A BCD：／EG M： 灰質(zhì)； WM： 白質(zhì) ； 標(biāo)尺 ： 5 0m ．圖 3 抗 N o g o - 6 6多抗 檢測 N o g o 分子在成年大 鼠脊髓 組織 中的分布 N o g o - 6 6蛋白( 2 0n g ／ m 1 ) 后 ， P C 1 2細(xì)胞突起生 長明 顯受到抑制 ， 突起數(shù)量減少 ， 長度也較短 ； 而 N o g o - 6 6多克

21、隆抗體可逆轉(zhuǎn) N o g o - 6 6蛋 白對 P C 1 2細(xì)胞 突起 生長的抑制作用 ( 圖 5 ) 。討 論 成年哺乳動物 C N S的再生能力極 為有 限， 很重 要 的一個原 因就是 C N S中存在很多抑制神經(jīng)突起 再生的分子 ， N o g o ． A就是 其 中之一 Ⅲ 4J 。而 N o g o ． 6 6是 N o g o ． A分子主要的抑制功能結(jié)構(gòu)域 。 目前研究 已證實 ， N o g o - 6 6 通過

22、與神經(jīng)元表面的 N o g o - 6 6 受體 N g R結(jié)合 ， 可抑制神經(jīng)元 突起 生長 ； 應(yīng)用 N o g o - A的中和抗體 或 N o g o - 6 6的競爭性拮抗肽 ¨ 可阻斷 N o g o - 6 6與 N g R的作用從而促進(jìn)損傷神經(jīng)元軸突再 生。這些發(fā)現(xiàn) 為 C N S損傷后的再生提供 了新 的研 究思路和治療靶點 ， 具有潛在的應(yīng)用價值。由于 N o g o - 6 6只有 6 6個氨基酸殘基

23、， 因此 ， 我 們采用 G S T - N o g o - 6 6 融合蛋白提高其免疫原性 。而 質(zhì)粒載體 p E T ． 2 8 a (+ ) 可表達(dá)帶有 6 個 H i s 標(biāo)簽的 融 合蛋 白， 它最大 的優(yōu)點是其表達(dá) 的蛋 白在天然或 一一■ ●一● ■一一 紅色代表 N o g o分 子； 綠 色 代表 各 類 神經(jīng) 細(xì) 胞 特異 性 標(biāo) 志 ： B —t u b l i n Ⅲ： 神經(jīng)元 ； R i p ： 少突膠質(zhì)細(xì)

24、胞 ； G F A P ： 星形 膠質(zhì)細(xì)胞 ； O X 一4 2 ： 小膠質(zhì)細(xì)胞 ； 白箭頭 ： 表示有共定位 ； 黃箭頭 ： 表示無共 定位 ；A ： N o g o 在神經(jīng)元胞體及突起近端有表達(dá)； B ： N o g o 在少突膠質(zhì)細(xì) 胞上表 達(dá)； C ： N o g o 在星形膠質(zhì)細(xì)胞 上未見 表達(dá) ； D ： N o g o 在小膠 質(zhì)細(xì)胞 上未見表達(dá) ； E ： 免疫前血清 陰性對照 ； 標(biāo)尺 ： 5 0m圖 4 抗 N o

25、g o - 6 6 多抗檢測 N o g o 分子在成 年大鼠脊髓 組織 中的細(xì)胞定位 一一 一一 C o n ： 對照組 ， 未加 N G F誘導(dǎo)分化 的 P C 1 2細(xì)胞 ； N G F ： 加 N G F 誘 導(dǎo)分化 后 的 P C 1 2細(xì)胞 ； N G F+ N o g o ： P C 1 2細(xì)胞 同時加 N G F 和 N o g o 蛋 白 ； N G F+ N o g o + A h ： P C 1 2細(xì)胞 同時加