重組Nogo-66蛋白的表達(dá)、純化和Nogo-66受體拮抗肽NAP2促進(jìn)神經(jīng)再生的體外研究.pdf

1、暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文題名（中英對照）：重組重組Nogo66蛋白的表達(dá)、純化和蛋白的表達(dá)、純化和Nogo66受體拮抗肽受體拮抗肽NAP2促進(jìn)神經(jīng)再生的體外研究促進(jìn)神經(jīng)再生的體外研究ExpressionpurificationofrecombinantNogo66proteinanovelNogo66receptantagonistpeptidepromotesneuriteregenerationinvitro作者姓名

2、：孫中輕指導(dǎo)教師姓名肖飛及學(xué)位、職稱：博士副教授副教授學(xué)科、專業(yè)名稱：藥理學(xué)藥理學(xué)學(xué)位類型：（學(xué)術(shù)學(xué)位學(xué)位類型：（學(xué)術(shù)學(xué)位專業(yè)學(xué)位）專業(yè)學(xué)位）藥理學(xué)藥理學(xué)論文提交日期：論文答辯日期：答辯委員會主席：論文評閱人：學(xué)位授予單位和日期：重組重組Nogo66蛋白的表達(dá)、純化和蛋白的表達(dá)、純化和Nogo66受體拮抗肽受體拮抗肽NAP2促進(jìn)神經(jīng)再生的體外研究促進(jìn)神經(jīng)再生的體外研究中文摘要中文摘要研究背景：研究背景：Nogo66作為髓鞘抑制蛋白Nog

3、oA的主要活性功能片段，與受體(NgR1)結(jié)合，在神經(jīng)發(fā)育和再生的過程中發(fā)揮多種生物學(xué)功能。NgR1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)外傷中發(fā)揮非常重要的作用，是抑制神經(jīng)再生的關(guān)鍵性受體。因此，NgR1被認(rèn)為是神經(jīng)再生領(lǐng)域的重要靶點(diǎn)。目的目的：本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)，獲得重組的Nogo66蛋白。然后運(yùn)用噬菌體展示技術(shù)篩選能夠與Nogo66競爭性結(jié)合其受體NgR1的小分子多肽，并驗(yàn)證其生物學(xué)功能，為NgR1為靶的小分子多肽治療神經(jīng)再生障礙疾病提供

4、新的依據(jù)。方法：方法：1.利用SUMO融合蛋白系統(tǒng)，采用PCR方法，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET20bSUMONogo66。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，表達(dá)融合蛋白SUMONogo66。然后用SUMO蛋白酶和組氨酸親和層析純化，得到重組蛋白Nogo66。2.利用Ph.D.7噬菌體展示肽庫，以NgR1為靶點(diǎn)經(jīng)過四輪生物淘選得到具有高特異性的單克隆噬菌體，用ELISA檢測它們與NgR1的結(jié)合能力。以Nogo66為基準(zhǔn)，分析比對陽性序列的相似度，疏水輪

5、廓。采用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證候選肽與NgR1的結(jié)合能力。采用鏈霉素親和素結(jié)合實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證候選肽是否和NgR1直接結(jié)合，并測量其解離常數(shù)。用神經(jīng)元突起抑制模型來研究多肽的促神經(jīng)再生功能。Westernboltting來檢測NgR1下游信號的表達(dá)情況，ROCK2，pCRMP2，pMLC。結(jié)果：結(jié)果：1.1.構(gòu)建并獲得目的基因SUMONogo66，將其克隆至載體質(zhì)粒pET20b中，獲得重組表達(dá)的質(zhì)粒pET20bSUMONogo66。在大腸桿菌中