大鼠脊髓損傷后Nogo蛋白受體在浸潤巨噬細胞中的表達及作用.pdf

1、軸突再生并與靶細胞形成功能性突觸結構是脊髓損傷修復的主要目標和關鍵問題，目前大量促進軸突再生的基礎研究顯示成體哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷早期再生失敗的主要原因是由于髓鞘抑制物的存在。我們在前期實驗中發(fā)現(xiàn)，將神經(jīng)干細胞和(或)嗅鞘細胞移植到受損脊髓局部，可觀察到神經(jīng)干細胞可分化為神經(jīng)元及其它神經(jīng)膠質細胞，神經(jīng)突觸形成增加，并觀察到脊髓全橫斷損傷大鼠BBB運動功能評分改善，盡管實驗中觀察到不少受損神經(jīng)再生或(和)出芽(待發(fā)表資料)，但受損局部

2、微環(huán)境的改變使軸突再生或出芽的距離極為有限，難以沖破髓鞘抑制因子與膠質瘢痕形成的屏障與遠側斷端形成有功能突觸。
　　 髓鞘碎片中的某些特異性成分(比如：Nogo66、髓鞘相關糖蛋白MAG、少突膠質細胞髓鞘糖蛋白OMgp等)作用于軸突上的Nogo受體(NgR)及其共受體p75NTR復合物，通過小鳥嘌呤核苷三磷酸酶(small GTPase)Rho途徑調節(jié)軸突內細胞骨架結構抑制軸突生長，從而使脊髓損傷修復難以獲得滿意結果。Nogo單

3、克隆抗體IN-1可以拮抗Nogo的抑制作用，但無法與另外兩種抑制物MAG和OMgp結合。GrandPre等嘗試以競爭性短肽NEPI-40來拮抗NgR的作用，結果顯示NEP1-40可對抗Nogo-66誘導的軸突生長抑制，但對除Nogo-66外的其他髓鞘抑制物不敏感，使其在體內應用的效果并不十分理想，表明該短肽并不能封閉NgR所有與抑制分子結合的位點。因此，找到一種有效且靶向性強的髓鞘碎片清理方法成為當務之急。
　　 目前，人們對巨

4、噬細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復中的作用存在著兩種截然相反的觀點，一種認為巨噬細胞對軸突生長有抑制作用；而另一種則認為巨噬細胞對軸突的再生起到促進作用。在整個機體組織的修復過程中，炎性反應貫穿始終，而炎性細胞中，巨噬細胞發(fā)揮了主要作用，它能清除壞死組織并分泌營養(yǎng)因子，并可在機體組織修復中起著重要作用。Mantovani等認為，巨噬細胞受炎性反應中微環(huán)境不同信號影響，可轉變?yōu)椤斑x擇”活化型和“經(jīng)典”活化型兩種。“選擇”活化型巨噬細胞由IL-4

5、和糖皮質激素誘導轉換而來，可調整免疫炎性反應的過程，清除壞死組織的殘片，促進血管再生、組織修復和重建；“經(jīng)典”活化型巨噬細胞可分泌前炎性細胞因子，加重炎癥反應，對受損局部細胞造成更進一步的損害。近年來，對于巨噬細胞在脊髓損傷致傷及修復作用報道并不多見。
　　 新近研究表明巨噬細胞在髓鞘碎片吞噬、促進軸突再生及再髓鞘化過程中發(fā)揮的作用可能比我們預想的更大。
　　 1998年，Zeev-Brann報道成熟哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)

6、損傷后的自我修復中出現(xiàn)脊髓衍生炎性細胞，Buss與Schwab等研究發(fā)現(xiàn)SCI大鼠髓鞘碎片清理細胞ED-1免疫組織化學染色呈陽性反應，即為小膠質細胞與巨噬細胞。MASAAKI通過鼠脊髓挫傷模型(代表挫傷引起的有髓鞘碎片和髓鞘再生受抑制)與化學性脫髓鞘模型(代表早期髓鞘碎片清除和髓鞘再生的多發(fā)性硬化癥)的對比，研究了巨噬細胞聚集及其作用，作者使用綠色熒光蛋白轉基因小鼠的骨髓細胞分別移植到經(jīng)放射線照射的脊髓挫傷模型鼠與化學性脫髓鞘模型鼠尾靜

7、脈，通過損傷脊髓免疫組化染色研究活化巨噬細胞的浸潤和殘留髓鞘碎片的不同水平變化，結果顯示表達綠色熒光蛋白的活化巨噬細胞構成損傷局部主要細胞群，表明兩個模型中的巨噬細胞主要來源于骨髓，很少來源于內在的小膠質細胞。在免疫染色顯示在挫傷模型當中，髓鞘碎片長時間持續(xù)存在，并且活化巨噬細胞的浸潤在挫傷模型中比化學模型中更慢并且數(shù)目顯著減少，同時傷后2～4天RT-PCR檢測趨化因子(MCP-1、GM-CSF)低水平表達，提示活化巨噬細胞浸潤的延遲與

8、挫傷性脊髓損傷后髓鞘碎片的持續(xù)存在有關，且導致髓鞘再生抑制。
　　 Samuel David等研究了Nogo受體(NgRs)在周圍神經(jīng)損傷中的作用。研究人員損傷鼠坐骨神經(jīng)，他們發(fā)現(xiàn)，一旦巨噬細胞到達受損部位并開始清除工作，它們就表現(xiàn)為表面表達NgR1的活化形式，并進入施旺細胞細胞基底部。當恢復的神經(jīng)開始產生新的蛋白質髓鞘(表達NgR配體如MAG等)，這種受體不但抑制巨噬細胞與髓鞘的結合，還會直接抑制髓鞘的形成，當研究人員再次損傷

9、神經(jīng)，使髓鞘不能形成時，巨噬細胞繼續(xù)留在受損神經(jīng)外層施旺細胞細胞基底部吞噬髓鞘碎片。然而，NgR1基因敲除鼠坐骨神經(jīng)或使用Y-27632抑制NgR下游Rho相關激酶，可增加巨噬細胞與髓鞘的結合率，證實巨噬細胞表達的NgR參與介導該細胞在周圍神經(jīng)損傷修復中的撤離過程。有關中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中巨噬細胞是否表達NgR及二者在中樞神經(jīng)系統(tǒng)尤其是脊髓損傷修復中的作用有待進一步研究。
　　 脊髓損傷后，活化的巨噬細胞浸潤脊髓損傷區(qū)，髓鞘碎片的

10、清除延緩導致了軸突延伸的抑制，和由于星形膠質細胞的堆積形成的瘢痕導致了軸突再生的抑制。我們推測，成年哺乳動物脊髓損傷后，活化巨噬細胞迅速清除髓鞘碎片對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生與對周圍神經(jīng)系統(tǒng)的再生具有同樣重要的意義，但對于巨噬細胞在脊髓損傷中的具體作用仍需深入研究。
　　 研究目的：
　　 制備大鼠脊髓損傷模型，分離、培養(yǎng)、鑒定大鼠脊髓損傷局部浸潤的巨噬細胞，觀察其是否表達NgR；構建大鼠NgR基因慢病毒載體并轉染巨噬細胞表達

11、NgR，探討轉染免疫細胞的可行性；比較NgR的表達對巨噬細胞吞噬功能的影響；體外構建神經(jīng)元損傷模型，將表達NgR的巨噬細胞、空載組巨噬細胞及不表達NgR的普通巨噬細胞與損傷的神經(jīng)元細胞共同培養(yǎng)，比較各組巨噬細胞對損傷神經(jīng)元修復、存活、分化的影響，探討表達NgRs的巨噬細胞在脊髓損傷修復中的可能作用機制，為進一步動物研究及臨床應用提供實驗和理淪依據(jù)。
　　 內容和方法：
　　 (一)制備大鼠脊髓損傷模型，第3天及第7天時取

12、材，使用免疫熒光化學染色觀察巨噬細胞浸潤及NgRs的表達情況。用酶消化法分離，獲取損傷脊髓組織局部浸潤的巨噬細胞，使用雙標免疫熒光化學染色從細胞水平觀察巨噬細胞表達NgRs情況；
　　 (二)采用RT-PCR技術獲得大鼠NgR基因編碼區(qū)片段，限制性內切酶酶切和基因重組構建慢病毒載體質粒，在脂質體介導下包裝質粒，包膜質粒共轉染293T細胞包裝生產慢病毒。所獲慢病毒感染大鼠巨噬細胞后，PCR檢測巨噬細胞中NgR基因的插入和表達。

13、r>　　 (三)將髓鞘堿性蛋白(MBP)加入轉染NgRs的巨噬細胞、空載組巨噬細胞和未轉染NgRs的巨噬細胞培養(yǎng)皿中，Western blot定量檢測巨噬細胞吞噬的MBP量，行t檢驗(Student's t-test)，取α=0.05。
　　 (四)制備體外神經(jīng)元損傷模型，將表達NgR的巨噬細胞、空載組巨噬細胞及不表達NgR的普通巨噬細胞與損傷的神經(jīng)元細胞共同培養(yǎng)，各組分別于損傷后30min、1h、6h、12h、24h、48h

14、、72h各時間點提取培養(yǎng)液100μL，檢測LDH含量并采用MTT比色法測量其存活細胞的吸收值。倒置相差顯微鏡下觀察各組不同時間神經(jīng)元的形態(tài)變化，采用重復測量數(shù)據(jù)方差分析進行統(tǒng)計學分析。
　　 研究結果：
　　 (一)在假手術組中，脊髓組織中沒有浸潤的巨噬細胞；免疫熒光染色顯示脊髓損傷3天后浸潤的巨噬細胞表面可表達NgR，傷后7天時表達NgR的巨噬細胞的數(shù)量明顯增多。培養(yǎng)脊髓損傷局部浸潤的巨噬細胞，免疫熒光染色顯示該細胞N

15、gRs抗原染色陽性；
　　 (二)所獲的NgR基因經(jīng)測序后與Gen Bank報道序列完全一致。重組慢病毒載體質粒經(jīng)鑒定正確。三質粒共轉染293T細胞成功，收集、濃縮病毒后測定其滴度為6.7×107Tu/mL，PCR證實NgR基因插入病毒基因組。感染巨噬細胞后RT-PCR檢測試驗組NgR-巨噬細胞組更大量表達NgR，與其余2組(Mock-巨噬細胞組、巨噬細胞組)比較差異具有統(tǒng)計學意義；
　　 (三)NgR轉染巨噬細胞組的M

16、BP含量比非轉染組MBP含量明顯增加，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，空載組與非轉染組無明顯的差異(P＞0.05)；
　　 (四)表達NgR的巨噬細胞、空載組巨噬細胞及不表達NgR的普通巨噬細胞與損傷的神經(jīng)元細胞共同培養(yǎng)0.5，1，6，12小時后，各組OD值沒明顯不同。24h后，神經(jīng)損傷+NgR轉染組比其他組有明顯的差異(P＜0.05)，空載組與非轉染組沒明顯的差異(P＞0.05)，NgR轉染組與正常神經(jīng)組無明顯差別(P＞

17、0.05)。隨時間延長，LDH水平在損傷神經(jīng)組中下降明顯但在NgR轉染組下降不明顯；培養(yǎng)0.5，1，6，12h后，各組OD值沒明顯差別；24h后，神經(jīng)損傷+NgR轉染組與其他組比較有明顯的差異(P＞0.05)，空載組與非轉染組沒明顯的差異(P＞0.05)，NgR轉染組與正常神經(jīng)組無明顯差別(P＞0.05)。
　　 實驗結論：
　　 成功制備脊髓損傷模型，從組織學和細胞水平證實損傷脊髓組織局部浸潤的巨噬細胞表面有NgRs的