Ryanodine受體在大鼠脊髓白質(zhì)損傷中的作用研究.pdf

1、脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后髓內(nèi)白質(zhì)的變性死亡是截癱患者運動功能難以恢復的重要原因之一。少突膠質(zhì)細胞死亡和軸突變性是白質(zhì)損傷的重要病理改變，但發(fā)生機制尚未完全闡明。我們課題組在前期預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，控制胞內(nèi)鈣池鈣釋放的一個重要通道——Ryanodine受體（RyR）在脊髓損傷后表達明顯增高，且定位于少突膠質(zhì)細胞和軸突，強烈提示RyR介導的胞內(nèi)鈣釋放可能參與脊髓白質(zhì)損傷的發(fā)生發(fā)展。為此，本論文擬在大鼠SCI損傷模

2、型上，研究RyR不同亞型在脊髓白質(zhì)中的細胞定位和SCI后的表達變化；利用藥物干預(yù)的方法，探討RyR對脊髓白質(zhì)損傷的作用；通過動物行為學試驗研究RyR對大鼠運動功能恢復的影響，以揭示RyR的新功能，為闡明脊髓白質(zhì)損傷機制和防治策略提供實驗依據(jù)。
　　第一部分、RyR不同亞型在脊髓白質(zhì)中的細胞定位和SCI后的表達變化
　　目的：檢測RyR不同亞型（RyR1、RyR2、RyR3）在脊髓白質(zhì)中的細胞定位和大鼠SCI損傷后的表達變化。

3、
　　方法：通過免疫組織化學染色法，檢測正常大鼠脊髓中RyRs在CNPase+少突膠質(zhì)細胞、NF200+神經(jīng)纖維、GFAP+星形膠質(zhì)細胞及NeuN+神經(jīng)元中的定位情況；采用鉗夾法制作大鼠SCI模型，在SCI后0h、4h、12h、24h、48h和72h處死動物，利用免疫組織化學染色法和RT-PCR法檢測RyRs在SCI后白質(zhì)損傷處的表達變化。
　　結(jié)果：
　　1）免疫組織化學雙標記染色結(jié)果顯示：三種RyR亞型在脊髓中均有

4、表達，并定位于白質(zhì)的CNPase+少突膠質(zhì)細胞和NF200+神經(jīng)纖維中；同時發(fā)現(xiàn)RyRs亦表達于GFAP+星形膠質(zhì)細胞及NeuN+神經(jīng)元；
　　2）RyRs免疫組織化學染色和RT-PCR結(jié)果顯示：隨著大鼠SCI損傷后時間點的推移，損傷處脊髓白質(zhì)RyRs的表達逐漸增加，并在24h達到峰值。
　　結(jié)論：RyRs表達于脊髓白質(zhì)的少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)纖維；SCI損傷后其表達水平顯著增高，提示RyRs可能參與SCI后脊髓白質(zhì)損傷的過程。

5、
　　第二部分、改變RyR活性對大鼠SCI后脊髓白質(zhì)損傷的影響
　　目的：探討RyR是否參與大鼠SCI后的脊髓白質(zhì)損傷。
　　方法：給SCI損傷大鼠腹腔注射RyR激動劑咖啡因和RyR抑制劑丹曲林后，將動物隨機分為四組：假手術(shù)組（Sham組）、脊髓損傷組（SCI組）、咖啡因處理組（CA組）和丹曲林處理組（DA組）；利用CNPase免疫組織化學染色和TUNEL染色法，檢測各組大鼠脊髓白質(zhì)損傷處少突膠質(zhì)細胞的數(shù)目變化；通過N

6、F200免疫組織化學染色和Western blot法，檢測脊髓白質(zhì)軸突的損傷情況；應(yīng)用透射電鏡法，觀察各組白質(zhì)髓鞘的損傷情況并用Western blot法檢測損傷部位髓鞘相關(guān)蛋白MBP和CNPase表達變化。
　　結(jié)果：
　　1）與SCI組（7.56±1.19）相比，RyR激動劑咖啡因顯著增加脊髓損傷處少突膠質(zhì)細胞的凋亡數(shù)目（15.27±2.40，P＜0.05）；相反，RyR抑制劑丹曲林可減少其凋亡（SCI組7.56±1.1

7、9 vs. DA組2.35±0.48，P＜0.05）；
　　2）與Sham組相比，SCI組軸突纖維斷裂、排列紊亂、NF200蛋白表達量降低（P＜0.05）；與SCI組相比，CA組軸突纖維進一步斷裂，多呈顆粒狀，NF200蛋白表達量進一步降低（P＜0.05）；相反，DA組軸突纖維較長，排列尚規(guī)則，NF200蛋白表達明顯增高（P＜0.05）；
　　3）電鏡結(jié)果顯示，SCI后白質(zhì)損傷處髓鞘板層分離、厚度減少；施加咖啡因后進一步引起

8、髓鞘脫失、變薄，但丹曲林則可明顯減少髓鞘板層分離和變薄。另外，SCI組脊髓損傷處髓鞘相關(guān)蛋白MBP和CNPase的蛋白表達量減少（P＜0.05，Sham組vs.SCI組）；咖啡因進一步降低兩者的表達（P＜0.05，SCI組 vs. CA組），而丹曲林則可抑制二者的減少（P＜0.05，SCI組 vs.DA組）。
　　結(jié)論：增強RyR活性可加重大鼠SCI后脊髓白質(zhì)的損傷程度，減弱RyR活性則可減輕白質(zhì)損傷，提示RyR在SCI后脊髓白質(zhì)

9、損傷中發(fā)揮重要作用。
　　第三部分、改變RyR活性對SCI后大鼠運動功能恢復的影響
　　目的：研究改變RyR活性對SCI后大鼠后肢運動功能恢復的影響。
　　方法：制作SCI模型后，將大鼠隨機分為三組：SCI組、CA組和DA組。分別在術(shù)后3d、7d、14d、21d、28d，觀察各組大鼠后肢運動功能情況，并按照脊髓損傷BBB運動功能評分量表記錄大鼠各個時間點的評分。
　　結(jié)果：隨著SCI后時間的推移，三組大鼠后肢運動