雌激素膜受體GPR30在脊髓損傷中的作用研究.pdf

1、背景及目的：脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是平戰(zhàn)時常見的一種嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷,常導(dǎo)致病人四肢不同程度的癱瘓或大小便障礙,不僅給病人造成痛苦,也加重社會及家庭負(fù)擔(dān)。SCI在世界上總發(fā)生率20-40人/百萬人/年,美國發(fā)生率為28～55人/百萬人/年,每年新增病例約1萬人,損傷時平均年齡為31.7歲。每年護(hù)理與治療這些病人的總費用超過70億美元。我國沒有全面的統(tǒng)計,但北京市統(tǒng)計2002年脊髓損傷發(fā)病率為60人/百萬

2、,遠(yuǎn)高于美國和世界總體水平,隨著中國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,交通、建筑及煤礦事故等導(dǎo)致的SCI越來越成為威脅人類健康和生活質(zhì)量的首要問題。SCI所致殘疾目前尚無有效治療方法,神經(jīng)功能恢復(fù)一直是臨床治療的難題,因此關(guān)于脊髓損傷與修復(fù)的研究,無論從其社會意義還是科學(xué)意義上來說都是非常必要和迫切的。當(dāng)前關(guān)于脊髓損傷修復(fù)的研究取得了長足的進(jìn)展,歸納起來主要有以下幾方面:(1)神經(jīng)保護(hù)(Neuroprotection)方面的研究,脊髓遭受創(chuàng)傷后除原發(fā)損傷外,

3、更重要的是通過各種機(jī)制(如缺血缺氧、興奮性氨基酸毒性、離子穩(wěn)態(tài)失衡、鈣超載、細(xì)胞凋亡及炎癥等)導(dǎo)致繼發(fā)損傷,是引起脊髓功能喪失的主要原因。原發(fā)損傷很難挽救,而繼發(fā)損傷則可搶救。(2)神經(jīng)再生(Neuroregeneration)的研究,此領(lǐng)域在上世紀(jì)90年代進(jìn)展較大,主要發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有再生能力,但由于外部微環(huán)境導(dǎo)致神經(jīng)再生受抑制,如神經(jīng)再生抑制分子、膠質(zhì)瘢痕及囊腔等的物理及化學(xué)性屏障。(3)神經(jīng)移植(Neurotransplant

4、ation),主要通過外周神經(jīng)、組織工程、(各種來源的)干細(xì)胞等的移植橋接壞死區(qū)、促進(jìn)再生來修復(fù)損傷脊髓。(4)神經(jīng)可塑性或神經(jīng)重塑(Neuroplasticity),研究發(fā)現(xiàn)SCI后患者是可以自行恢復(fù)部分功能,這和脊髓自發(fā)可塑性有關(guān),只要殘留少部分的神經(jīng)纖維,對脊髓功能重建的即有很大的幫助,因此臨床常通過康復(fù)理療等幫助患者脊髓功能的重建。
　　 雖然上述策略在動物實驗中取得了較好的效果,但臨床療效不盡如人意,循證醫(yī)學(xué)的證據(jù)顯示

5、針對繼發(fā)損傷的藥物,如被大家寄予厚望的NMDA受體抑制劑、神經(jīng)節(jié)苷脂、自由基清除劑等均對SCI無效。由此可見促脊髓損傷修復(fù)、再生的策略之路還很遙遠(yuǎn),因此,尋找脊髓損傷與修復(fù)新的突破點和新的治療靶點,具有重要的醫(yī)學(xué)價值和社會意義。
　　 很早人們己注意到中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)損傷后,女性患者的功能恢復(fù)及預(yù)后往往較男性好,進(jìn)一步的臨床研究(包括流行病學(xué)調(diào)查)及動物實驗也得到了類似的發(fā)現(xiàn),

6、并推廣到神經(jīng)創(chuàng)傷和神經(jīng)退行性疾病(如Alzheimer's病、Parkinson's病),眾多學(xué)者認(rèn)為這主要是和雌激素有關(guān),證明雌激素對神經(jīng)損傷是具有明確的保護(hù)作用的。長期以來,可溶性細(xì)胞內(nèi)雌激素受體Erα/β(ER)一直被認(rèn)為是其作用的唯一受體。該類受體通過與雌激素結(jié)合,發(fā)生構(gòu)象變化,并轉(zhuǎn)移到核內(nèi)與特定的DNA系列一雌激素反應(yīng)元件(estrogen responsive element,ERE)結(jié)合,調(diào)控一系列基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá),從而影

7、響細(xì)胞的發(fā)育、增殖、凋亡等。此途徑為雌激素的經(jīng)典途徑,一般耗時較長,需數(shù)小時到數(shù)天,稱為雌激素的慢速基因作用。但有大量的研究顯示雌激素可在數(shù)十秒、數(shù)分鐘到數(shù)十分鐘內(nèi)起效,如調(diào)節(jié)血管張力、快速促進(jìn)NO釋放、Ca2+動員等。均提示雌激素除通過經(jīng)典的慢速基因途徑外,尚通過未被人們認(rèn)識的非基因機(jī)制快速起效。在2005年Science刊文以充分的證據(jù)表明確實存在新的雌激素受體-GPR30(一種G蛋白耦聯(lián)受體)介導(dǎo)了雌激素的快速作用途徑,因此作為介

8、導(dǎo)雌激素快速作用的膜受體在雌激素對脊髓損傷的保護(hù)作用中可能是具有重要作用的,是脊髓損傷修復(fù)研究的一個重要的新靶點。
　　 目的：
　　 1.觀察GPR30在正常大鼠脊髓內(nèi)的空間的分布規(guī)律和在脊髓細(xì)胞上的表達(dá)情況。
　　 2.了解SCI后經(jīng)E2、E2-BSA、G-1、生理鹽水干預(yù)后大鼠的運動功能恢復(fù)情況及GPR30的蛋白表達(dá)情況。
　　 方法
　　 1.本課題以成年雌性SD大鼠為研究對象,對正常成年

9、大鼠脊髓進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究:用免疫組化染色的方法,觀察GPR30在脊髓的頸、胸、腰、骶各節(jié)段的空間分布特點;運用免疫熒光雙標(biāo)記法觀察GPR30在大鼠脊髓中的細(xì)胞定位,探討GPR30在脊髓損傷中可能起到的作用。2.建立脊髓打擊傷實驗?zāi)Ｐ?圍繞正常組、SCI組、SCI+E2組、SCI+E2-BSA組、SCG-1組之間的對比進(jìn)行以下研究:1)功能學(xué)研究:對各組的大鼠進(jìn)行大鼠下肢運動功能評分(BBB評分),對各組結(jié)果進(jìn)行比較,初步探討GPR30在S

10、CI中的作用。2)運用Western-blotting技術(shù)對干預(yù)各組的脊髓組織的GPR30的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測,比較各組間GPR30的蛋白水平變化,進(jìn)一步揭示GPR30在SCI中所起的作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.GPR30在正常大鼠脊髓各節(jié)段的空間分布情況:GPR30可見在大鼠的脊髓各節(jié)段均有明確的表達(dá),但主要表達(dá)在脊髓灰質(zhì),在白質(zhì)中的分布情況各節(jié)段基本類似呈均勻分布,未見表達(dá)密集處,但在灰質(zhì)中的分布存在一定的差異

11、。GPR30在頸段脊髓灰質(zhì)中主要分布在灰質(zhì)的腹角,在中央管周圍亦可見較多表達(dá),在背角基本未見GPR30的表達(dá),但在靠近背角的灰質(zhì)中可見有GPR30陽性信號。GPR30在胸段脊髓灰質(zhì)中仍主要在腹角分布,但在中央管周圍僅見極少量分布,在背角及背角周圍灰質(zhì)均未見明顯GPR30的陽性信號。GPR30在腰段脊髓灰質(zhì)中仍主要在腹角分布,在灰質(zhì)的聯(lián)合部可見極少量分布,但在背角及周圍灰質(zhì)均可見有不少GPR30陽性信號的分布。在骶髓內(nèi)可見GPR30仍主要

12、在灰質(zhì)的腹角分布且分布較稀,未見明顯聚集,在灰質(zhì)背角未見明顯分布。從細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位來看,GPR30在脊髓各節(jié)段的灰質(zhì)細(xì)胞內(nèi)均在胞漿胞膜中表達(dá),在核內(nèi)沒有檢測到GPR30陽性信號。
　　 2.GPR30在正常大鼠脊髓細(xì)胞上的表達(dá)情況:運用免疫熒光雙標(biāo)染色技術(shù),對正常大鼠脊髓染色,觀察可見出GPR30在脊髓中的神經(jīng)元有明確的表達(dá),在少突膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞上也有表達(dá),但在星形膠質(zhì)細(xì)胞上未見表達(dá)。
　　 3.功能學(xué)研究顯示:SC

13、I后按假手術(shù)對照、SCI組、E2組、E2-BSA組、G-1組分組給予干預(yù)后進(jìn)行BBB評分,結(jié)果如下:
　　 按分組給予不同干預(yù)條件各組在各時間點的BBB評分(分,-x±S,n=5)
　　 4.用Western-blotting技術(shù)檢測各干預(yù)組的GPR30蛋白表達(dá)水平
　　 結(jié)果：顯示:鹽水組、E2組、E2-BSA組和G-1組GPR30的蛋白水平均較正常對照組高。損傷后各干預(yù)組間比較可見鹽水組蛋白表達(dá)量顯著低于E2

14、組、E2-BSA組、G-1組,且鹽水組的蛋白表達(dá)增長趨勢同E2組是基本一致的。E2組蛋白表達(dá)水平在損傷后的初期階段上升較慢,在第十四天左右達(dá)到最高值,此后蛋白表達(dá)水平緩慢減少,E2組在第1、3天蛋白表達(dá)水平是顯著高于E2-BSA組,但是在第7天可見E2-BSA組蛋白表達(dá)水平快速增加,表達(dá)量顯著超過E2組。E2-BSA組在損傷后的3天以內(nèi)蛋白表達(dá)水平也上升很緩慢,但在第七天左右表達(dá)水平達(dá)到最高值。G-1組蛋白表達(dá)水平則是在損傷后的初期節(jié)段

15、就開始快速增加,在第3天就已經(jīng)顯著高于其它各組,并在第7天左右達(dá)到最高值,此后蛋白表達(dá)量開始快速減少,并在第14天時開始明顯低于E2組的表達(dá)水平。
　　 結(jié)論：
　　 1.正常成年雄性大鼠脊髓中,雌激素膜受體GPR30在脊髓灰白質(zhì)中均有表達(dá),但主要分布在灰質(zhì)中,且主要表達(dá)在脊髓腹腳運動神經(jīng)元。
　　 2.正常成年雄性大鼠脊髓細(xì)胞中,GPR30在神經(jīng)元的胞漿上有表達(dá),在小膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞上也明確存在表達(dá),而在