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文檔簡介
1、目的:子宮肌瘤是婦科的常見病,其發(fā)病機制尚不清楚。大量的研究表明子宮平滑肌瘤的發(fā)生與雌激素的關(guān)系密切。傳統(tǒng)雌激素核受體ERα、β作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子已被廣泛接受,但是大量的研究表明子宮肌瘤患者和正常育齡期婦女的循環(huán)血液中雌激素的水平?jīng)]有明顯差異,這提示子宮肌瘤的發(fā)生與局部的雌激素效應(yīng)有關(guān)??缒蛋白偶聯(lián)受體(GPR30)(G protein-coupled receptors, G蛋白偶聯(lián)受體)分子量大小約40KD,基因定位于染色體7p22
2、上,主要位于細胞質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,是激活ERK-1/2的另一類主要的跨膜信號受體蛋白。GPR30有α、β、γ、和δ四個亞基。多項研究證實GPR30可與雌激素特異性結(jié)合快速介導(dǎo)雌激素效應(yīng),這可能與育齡婦女子宮局部高雌激素效應(yīng)的表達有關(guān)。本研究希望可以進一步探索GPR30在子宮肌瘤發(fā)病中的作用。
方法:⑴取材,子宮平滑肌瘤原代細胞培養(yǎng),培養(yǎng)成功后7-8天傳代。⑵平滑肌瘤細胞鑒定,應(yīng)用HE染色法,在倒置相差顯微鏡下觀察細胞大小、形態(tài)、生
3、長特點及排列方式等進行平滑肌瘤細胞鑒定。⑶免疫熒光法分析GPR30在子宮平滑肌瘤細胞中的表達。⑷蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測子宮肌瘤細胞中GPR30的表達。⑸蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測未處理組子宮肌瘤細胞及添加雌二醇的子宮肌瘤細胞在培養(yǎng)24h、48h后細胞中Erk1/2表達的差異。⑹蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測正常子宮肌瘤細胞及GPR30-siRNA轉(zhuǎn)染的子宮肌瘤細胞在培養(yǎng)24h、48h
4、后細胞中Erk1/2表達的差異。⑺使用MTT方法并以時間和OD570數(shù)值繪制細胞生長曲線。
結(jié)果:①培養(yǎng)1天后,大部分細胞已貼壁。換液后3天貼壁細胞完全伸展。多數(shù)呈長梭型,細胞伸出較長的突起并相互接觸,部分區(qū)域可見典型的“峰—谷”結(jié)構(gòu),培養(yǎng)7-8天細胞鋪滿瓶底,并鑒定為平滑肌細胞。②Western Blot檢測人子宮肌瘤以及正常子宮平滑肌組織中GPR30蛋白的表達情況,結(jié)果顯示GPR30在子宮平滑肌瘤和正常子宮平滑肌組織中皆有
5、表達。③Western Blot表明在雌激素的作用下,子宮平滑肌瘤細胞中Erk1/2的表達較未處理組正常子宮平滑肌瘤細胞顯著升高;經(jīng)siRNA干擾GPR30后,干擾組子宮平滑肌瘤細胞中Erk1/2的表達顯著低于未處理組平滑肌細胞。④細胞生長曲線分析顯示,在雌激素的刺激下,空白載體對照組細胞的生長明顯上升(OD數(shù)值增加),GPR30干擾組細胞的生長活性和生存率顯著下降。
結(jié)論:GPR30在子宮肌瘤平滑肌瘤細胞的細胞漿中高表達,可
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