雌激素膜受體GPR30對(duì)山羊卵母細(xì)胞成熟過程中卵丘擴(kuò)展的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、卵丘細(xì)胞是一種高度特異性的細(xì)胞，圍繞在有腔卵泡卵母細(xì)胞以及早期胚胎的周圍。卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的聯(lián)系對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟有著重要的作用。研究顯示卵丘擴(kuò)展是卵母細(xì)胞成熟的首要形態(tài)學(xué)指標(biāo)并且高劑量的雌激素可明顯促進(jìn)卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展。雌激素核受體的兩種亞型ERα和ERβ廣泛分布在多種組織和細(xì)胞中，介導(dǎo)了雌激素的大部分作用，但是雌激素也可以快速調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的事件，如cAMP的產(chǎn)生，Ca2+的遷移等，這些快速的雌激素效應(yīng)并不涉及某些細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活

2、化，而是直接作用于細(xì)胞的表面。Filardo等發(fā)現(xiàn)了一種雌激素的膜受體G蛋白偶聯(lián)受體30(Gprotein-coupled receptor30，GPR30)，研究顯示GPR30可以在某些條件下快速介導(dǎo)上述雌激素事件。雖然GPR30在許多細(xì)胞和組織中扮演著重要的作用，但是在山羊卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞中是否也存在GPR30的表達(dá)，目前還沒有被報(bào)道出來。因而本研究首先檢測(cè)了體外培養(yǎng)山羊卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulus-oocytes com

3、plexes，COCs）24 h前后，GPR30的表達(dá)和定位。在確定GPR30存在于山羊COCs中的基礎(chǔ)上使用G1和G15進(jìn)一步研究了GPR30在山羊卵母細(xì)胞成熟過程中對(duì)卵丘擴(kuò)展的影響，并研究了GPR30介導(dǎo)的雌激素信號(hào)通路在山羊成熟培養(yǎng)過程中對(duì)卵丘擴(kuò)展的作用機(jī)制。其研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1)利用免疫熒光的方法，檢測(cè)了體外成熟培養(yǎng)24 h前后的山羊COCs中GPR30的定位與表達(dá)，結(jié)果顯示，在山羊卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞上都存在G

4、PR30的表達(dá)，并且定位在細(xì)胞質(zhì)膜上。另外，qRT-PCR和Western Blotting的結(jié)果顯示，體外成熟培養(yǎng)山羊COCs24 h前后，都有GPR30 mRNA和蛋白的表達(dá)，并且在體外培養(yǎng)24h后，COCs與卵丘細(xì)胞中GPR30 mRNA和蛋白表達(dá)水平都明顯較培養(yǎng)前高(P＜0.05)，成熟卵母細(xì)胞中GPR30 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著比成熟培養(yǎng)前低(P＜0.05)。
　　(2)在上述研究的基礎(chǔ)上，首先利用雌激素的特異性激

5、動(dòng)劑G1和特異性抑制劑G15研究了是否GPR30介導(dǎo)了雌激素對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響。體外成熟培養(yǎng)24 h后的山羊COCs，依照卵母細(xì)胞中第一極體的排出情況，統(tǒng)計(jì)17β-E2組、對(duì)照組、G1組和17β-E2與G15共同處理組中卵母細(xì)胞的成熟率。結(jié)果顯示，17β-E2組較對(duì)照組顯著促進(jìn)了山羊卵母細(xì)胞的成熟（P＜0.05），G1組也明顯較對(duì)照組中的成熟卵母細(xì)胞數(shù)量多(P＜0.05)，雖然G1組的成熟率低于17β-E2組的成熟率，但是兩組之間并沒

6、有顯著的差別(P＞0.05)，表明G1可以在一定程度上模仿17β-E2對(duì)卵母細(xì)胞成熟的促進(jìn)效應(yīng)。而G15與17β-E2共同處理COCs24 h后，卵母細(xì)胞的成熟率明顯較17β-E2組和G1組低(P＜0.05)，但是較對(duì)照組卻顯著增加了成熟卵母細(xì)胞的數(shù)量（P＜0.05），表明山羊卵母細(xì)胞的成熟受到了GPR30介導(dǎo)的雌激素信號(hào)通路的調(diào)控，至少部分由GPR30介導(dǎo)。
　　(3)為了研究雌激素的膜受體GPR30介導(dǎo)的雌激素信號(hào)通路在山羊卵

7、母細(xì)胞成熟過程中對(duì)卵丘擴(kuò)展的影響，將體外培養(yǎng)24 h后的山羊COCs，根據(jù)Vanderhyden等(1990)文獻(xiàn)中報(bào)道的卵丘擴(kuò)展分級(jí)和擴(kuò)展指數(shù)的評(píng)估方法，分別統(tǒng)計(jì)不同處理組和對(duì)照組中的卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展指數(shù)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，17β-E2單獨(dú)處理能夠明顯增加山羊卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展指數(shù)(P＜0.05)，并且G1也能夠增加山羊卵丘細(xì)胞擴(kuò)展指數(shù)，另外17β-E2與G15聯(lián)合處理COCs24 h后，卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展指數(shù)比對(duì)照組高，但是兩組之間沒有

8、明顯的差異(P＞0.05)，而與17β-E2組和G1組相比，卻降低了卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展指數(shù)。另外在體外培養(yǎng)山羊COCs24 h后，研究了上述各組中與卵丘擴(kuò)展有關(guān)基因（HAS2，PTGS2，PTX3，TNFAIP6）的相對(duì)表達(dá)水平，qRT-PCR的結(jié)果顯示，17β-E2組和G1組較對(duì)照組明顯增加了卵丘細(xì)胞中HAS2和PTX3 mRNA的表達(dá)水平（P＜0.05），但是PTGS2和TNFAIP6mRNA的表達(dá)水平在17β-E2組、G1組和17β-

9、E2和G15共同處理組中沒有明顯的差異(P＞0.05)。
　　(4)為了進(jìn)一步探討GPR30介導(dǎo)的雌激素信號(hào)通路對(duì)山羊卵母細(xì)胞成熟過程中卵丘擴(kuò)展的作用機(jī)制，采用ELISA的方法測(cè)定山羊COCs中的cAMP水平，結(jié)果顯示，17β-E2組能夠明顯較對(duì)照組增加山羊COCs中cAMP水平，G1組也能夠較對(duì)照組明顯增加cAMP的水平(P＜0.05)，進(jìn)一步表明雌激素與GPR30結(jié)合促進(jìn)了COCs中cAMP的產(chǎn)生。然而17β-E2組與G1組相

10、比，有著明顯的差異，G15處理山羊COCs2 h后也明顯較對(duì)照組中的cAMP水平高，但與17β-E2組和G1組相比較卻明顯低于上述兩組山羊COCs中的cAMP水平(P＜0.05)。另外根據(jù)之前的研究顯示ERK1/2可以促進(jìn)卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展，推測(cè)雌激素可能通過影響ERK1/2的磷酸化水平促進(jìn)卵丘的擴(kuò)展。因此將山羊COCs分別在對(duì)照組（未添加17β-E2）、G1(100nM)組、17β-E2（1μg/mL）+G15(100nM)組和17β-E

11、2(1μg/mL)組中培養(yǎng)30 min，探究了GPR30介導(dǎo)的雌激素信號(hào)通路對(duì)山羊COCs中ERK1/2的磷酸化水平的影響，蛋白質(zhì)免疫印跡的檢測(cè)結(jié)果顯示，17β-E2和G1分別單獨(dú)處理COCs30 min時(shí)明顯較對(duì)照組中的ERK1/2的磷酸化水平高，但G1組ERK1/2的磷酸化水平與17β-E2組ERK1/2的磷酸化水平相比卻有顯著的差異(P＜0.05)。然而G15的添加卻明顯降低了17β-E2對(duì)ERK1/2磷酸化水平的促進(jìn)作用，而且G

12、15與17β-E2共同處理組中的ERK1/2磷酸化水平依然顯著比對(duì)照組高(P＜0.05)，表明GPR30介導(dǎo)的17β-E2通過調(diào)控ERK1/2的磷酸化水平促進(jìn)了山羊卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展。
　　綜上所述，在體外培養(yǎng)24 h前后的山羊COCs中，卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞上都存在GPR30的表達(dá)，且定位在細(xì)胞的質(zhì)膜上。GPR30介導(dǎo)了17β-E2(1μg/mL)對(duì)山羊卵母細(xì)胞成熟的促進(jìn)作用。17β-E2(1μg/mL)通過GPR30增加山羊COCs