豬卵丘細(xì)胞核移植過(guò)程中卵母細(xì)胞末期去核相關(guān)問(wèn)題研究.pdf

1、在核移植過(guò)程中，供核細(xì)胞與受體胞質(zhì)是重構(gòu)胚的兩個(gè)重要構(gòu)件，尤其是受體胞質(zhì)對(duì)重構(gòu)胚核基因的重新編程及胚胎的發(fā)育至關(guān)重要。目前，大多數(shù)研究者都是采用MII期卵母細(xì)胞作為受體胞質(zhì)。但是該方法由于在去核時(shí)要抽取大量胞質(zhì)，而且還要用紫外線照射以檢查去核是否完全，因而對(duì)細(xì)胞損傷大影響重構(gòu)胚的發(fā)育。近年來(lái)有人采用激活MII期卵母細(xì)胞待其排出第二極體后，抽取第二極體及其周圍少量含核的胞質(zhì)來(lái)達(dá)到去核的目的，又稱為TII期去核。這種方法由于抽取的胞質(zhì)少，而

2、且不需要紫外線的照射，故而對(duì)細(xì)胞的損傷較小。 許多實(shí)驗(yàn)室對(duì)該方法進(jìn)行了研究，但是關(guān)于卵母細(xì)胞TII期去核對(duì)豬體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚發(fā)育的影響，目前國(guó)內(nèi)還尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本論文主要研究和比較了豬卵母細(xì)胞TII期去核方法與效果，在此基礎(chǔ)上還對(duì)豬卵母細(xì)胞TII期去核法生產(chǎn)核移植胚胎的程序進(jìn)行了優(yōu)化，為推廣應(yīng)用該技術(shù)生產(chǎn)豬的體細(xì)胞核移植胚胎提供一些數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)。 本實(shí)驗(yàn)在原有豬體細(xì)胞核移植技術(shù)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響豬卵母細(xì)胞TII期去核重構(gòu)胚

3、發(fā)育的幾個(gè)因素(卵母細(xì)胞預(yù)激活程序、核移植后核質(zhì)作用時(shí)間以及核供體細(xì)胞預(yù)處理方法)進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。 1、豬卵母細(xì)胞TII期預(yù)激活物質(zhì)的選擇。本實(shí)驗(yàn)以第二極體排出比率為指標(biāo)，分別選擇不同濃度的三種物質(zhì)，作用于豬成熟卵母細(xì)胞觀察統(tǒng)計(jì)預(yù)激活效果。5％、7％和10％乙醇濃度預(yù)激活豬卵母細(xì)胞排出第二極體的比率分別為20.83％(25/120)、25.00％(30/120)和22.50％(27/120)；采用濃度為μg/mL、6μg/mL、8

4、μg/mL，和10μg/mL的放線菌酮預(yù)激活豬卵母細(xì)胞后，第二極體的排出率分別為：16.67％(20/120)、19.17％(23/120)、25.83％(31/120)和20.83％(25/120)；濃度為5μmol/mL、10μmol/mL、15μmol/mL和20μmol/mL鈣離子載體A23187(CaA)預(yù)激活豬卵母細(xì)胞后第二極體的排出效果為54.17％(65/120)、58.33％(70/120)、64.17％(77/120

5、)和57.50％(69/120)，15μmol/mL，組效果最好，各濃度之間差異不顯著(p>0.05)。比較以上三種物質(zhì)預(yù)激活豬卵母細(xì)胞的效果發(fā)現(xiàn)15μmol/mL的CaA極顯著優(yōu)于其他兩種物質(zhì)(p<0.01)。 2、不同受體卵母細(xì)胞胞質(zhì)對(duì)豬體細(xì)胞核移植的影響。本實(shí)驗(yàn)以重構(gòu)胚卵裂率和4-細(xì)胞以上胚胎發(fā)育率為檢測(cè)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，以MII期中期去核和TII期去核的卵母細(xì)胞作為受體胞質(zhì)，經(jīng)血清饑餓的卵丘細(xì)胞作為核供體構(gòu)建重構(gòu)胚胎，比較兩種受

6、體胞質(zhì)對(duì)豬體細(xì)胞核移植效果的影響。結(jié)果表明：MII期中期去核的卵母細(xì)胞為核受體胞質(zhì)的卵裂率和4-細(xì)胞以上胚胎發(fā)育率均高于TII期去核的卵母細(xì)胞(31.67％vs24.17％，14.17％vs10.83％)，差異顯著(p<0.05)。說(shuō)明，MII期中期去核的卵母細(xì)胞更適宜作為核移植受體胞質(zhì)。 3、不同核質(zhì)作用時(shí)間對(duì)豬體細(xì)胞核移植的影響。采用電融合法將卵丘細(xì)胞移入去核的卵母細(xì)胞中，供體細(xì)胞在TII期去核的受體胞質(zhì)內(nèi)分別孵育0h、1h、2h、

7、3h、4h和5h后，1.3kV/cm、80μs、單次脈沖電激活重構(gòu)胚，以重構(gòu)胚卵裂率和4．細(xì)胞以上胚胎發(fā)育率為檢測(cè)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，比較不同核質(zhì)孵育時(shí)間對(duì)核移植效果的影響。結(jié)果表明：核質(zhì)孵育4h可以獲得較好的核移植效果，其卵裂率(35.83％(45/120))顯著高于其他幾組(22.50％、25.83％、26.67％、28.83％、30.83％，p<0.05)。4-細(xì)胞以上胚胎發(fā)育率與孵育3h組差異不顯著(12.50％vs12.50％,p>0.

8、05)。但與其它幾組相比差異顯著(12.50％vs 4.17％，9.17％，10.00％，7.50％,p<0.05)。說(shuō)明用TII期去核卵母細(xì)胞作為核受體胞質(zhì)，核質(zhì)孵育4h后再進(jìn)行補(bǔ)充性電激活可以提高豬體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚的發(fā)育率。 4、不同供核細(xì)胞預(yù)處理方法對(duì)核移植效果的影響。本實(shí)驗(yàn)將經(jīng)過(guò)血清饑餓處理的卵丘細(xì)胞作為對(duì)照組，分別用7％乙醇和鈣離子載體A23187(5μmol/L)預(yù)處理供核細(xì)胞，核移植重構(gòu)胚融合后，核質(zhì)孵育4h再激

9、活，比較兩種預(yù)處理方法對(duì)核移植重構(gòu)胚的影響。結(jié)果表明：用CaA預(yù)處理組的核移植重構(gòu)胚的卵裂率(37.50％vs30.83％)和4-細(xì)胞以上胚胎發(fā)育率(15.83％vs10.83％)均高于對(duì)照組，差異顯著(p<0.05)。卵裂率也略高于乙醇預(yù)處理組的核移植重構(gòu)胚卵裂率(37.50％vs34.16％，p>0.05)，但是4-細(xì)胞以上胚胎發(fā)育率顯著高于乙醇預(yù)處理組(15.83％vs9.17％，p<0.05)。由此可見(jiàn)，TII期去核的卵母細(xì)胞作

10、為核受體胞質(zhì)，用鈣離子載體預(yù)處理核供體細(xì)胞，核質(zhì)孵育4h再激活重構(gòu)胚，有利于核移植重構(gòu)胚的發(fā)育。 綜上所述，在以TII期去核的豬卵母細(xì)胞作為核受體胞質(zhì)時(shí)，最適宜的程序是：用濃度為15μmol/mL鈣離子載體處理卵母細(xì)胞5min，然后抽取第二極體及其周圍少量胞質(zhì)進(jìn)行去核。供核細(xì)胞用5μmol/mL鈣離子載體預(yù)處理后注入TII期去核的豬卵母細(xì)胞卵周隙內(nèi)，采用參數(shù)為1.0kV/cm、80μs、單次脈沖電融合法移入供體細(xì)胞核，構(gòu)建重構(gòu)胚