激活素-抑制素-卵泡抑素系統(tǒng)在卵母細(xì)胞成熟過程中的影響機制及其在未成熟卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)中的應(yīng)用.pdf

1、目前，人類尚無法完整揭示卵泡生長發(fā)育過程中的調(diào)控機理，主要原因在于對卵巢內(nèi)部因子作用機制了解不清。激活素-抑制素-卵泡抑素(activin-inhibin-follistatin，ACT-INH-FS)系統(tǒng)是最重要的卵巢內(nèi)部因子之一，其卵巢內(nèi)部的旁自分泌作用機制有待闡明。近年來，人類未成熟卵母細(xì)胞的體外成熟(in vitro matliration，IVM)技術(shù)在不育癥治療中顯示出重要的臨床價值。但其妊娠率、種植率以及自然流產(chǎn)率尚不理想

2、，主要原因在于尚未建立能夠使未成熟卵母細(xì)胞同步獲得細(xì)胞核和細(xì)胞漿成熟的培養(yǎng)體系。ACT-INH-FS作為卵泡體內(nèi)成熟微環(huán)境中的重要因子，可能也是IⅧ培養(yǎng)體系中不可或缺的組分。 本研究目的是通過以下三方面內(nèi)容，探討了激活素-抑制素-卵泡抑素系統(tǒng)，在卵母細(xì)胞成熟過程中的旁分泌作用機制及其在人類不成熟卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)中的應(yīng)用價值：1.激活素-抑制素-卵泡抑素系統(tǒng)對卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育潛能的影響。2.激活素-抑制素-卵泡抑素系統(tǒng)卵

3、巢局部生理作用的階段性與交互性。3.卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系的安全性相關(guān)研究。 第一部分，激活素．抑制素．卵泡抑素系統(tǒng)對卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育潛能的影響。 目的：探討激活素-抑制素-卵泡抑素系統(tǒng)在小鼠生發(fā)泡(GV)期卵母細(xì)胞體外成熟及早期胚胎發(fā)育中的的影響機制。 方法：3-4周齡昆明系雌性小鼠腹腔注射PMSG后48小時，獲取GV期卵母細(xì)胞隨機分入以下八組。對照組采用HTF+10％SPS；試驗組分別為：100ng/

4、ml ACTA：100ng/mlACTA+100ng/mlFS：100ng/mlINHA：100ng/mlINHA+100ng/mlFS：100ng/mlACTA+INHA：100ng/mlACTA+100ng/mlINHA+100ng/mlFS：100ng/ml FS。GV期卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)16-18小時后，M Ⅱ期的卵母細(xì)胞進行體外受精，觀察ACTA-INHA-FS對GV期卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂(GVBD)、第一極體(PB1)排出及受精

5、率、卵裂率、囊胚形成率的影響。使用MitoTracker RED熒光探針對ACTA組以及ACTA+INHA合用組MⅡ期卵母細(xì)胞內(nèi)活性線粒體數(shù)目及分布進行檢測。 結(jié)果：(1)ACTA、ACTA+INHA、單獨使用FS均可顯著促進GV期卵母細(xì)胞GVBD發(fā)生率(P<0.05)。(2)ACTA、ACTA+INHA、INHA均可顯著促進M Ⅱ期卵母細(xì)胞發(fā)生率(P<0.05)，(3)INHA組受精率低于對照組(P<0.05)，其余各組與對照

6、組相比，受精率無明顯差異(P>0.05)。(4)ACTA、INHA、ACTA+INHA組8細(xì)胞及囊胚形成率均顯著高于對照組(P<0.05)。(5)FS可以特異性拮抗．ACTA的促進作用，但不能中和ACTA與INHA的協(xié)同作用(P>0.05)。(6)單獨使用Fs組囊胚形成率高于對照組(40％vs 24.7％)，但差異尚不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.051)。(7)體外成熟后的MⅡ期卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)可以分為以下三類：周邊型、半周型、彌散型，

7、ACTA組以及ACTA+INHA合用組半周型以及彌散型的比例明顯高于對照組，整體分布存在顯著性差異(P<0.01)。 結(jié)論：(1)ACTA、INHA對GV期卵母細(xì)胞體外成熟及胚胎發(fā)育潛能具有顯著的促進作用，并可以被FS所拮抗。(2)在ACTA/INHA缺乏或不足的條件下，F(xiàn)S可出現(xiàn)ACTA樣作用，促進卵母細(xì)胞成熟。(3)ACTA-INHA對體外成熟卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟同步化具促進作用。 第二部分，激活素-抑制素-卵泡抑素系統(tǒng)

8、旁自分泌作用的階段性及交互性。 目的：探討生理周期中LH峰前后ACTA/INHA對GV期卵母細(xì)胞體外成熟的不同影響；激活素-抑制素-卵泡抑素系統(tǒng)與EGF的相互作用方式。 方法：3-4周性成熟前小鼠分為兩組，一組給予PMSG超排卵48小時后取卵，另一組予PMSG超排卵48小時后繼續(xù)給予HCG10U 2小時后取卵。HCG刺激(HCG+)組和HCG未刺激(HCG-)組的GV期卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物(COC)，在含有100ng/m

9、lACTA+100ng/mlINHA培養(yǎng)液中體外培養(yǎng)14-18小時，M Ⅱ期的卵母細(xì)胞進行體外受精，觀察ACTA-INHA-FS對GV期卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂(GVBD)、第一極體(PB1)排出及受精率、卵裂率、囊胚形成率的影響。GV期卵母細(xì)胞在含10ng/ml EGF及10ng/ml EGF+100ng/mlFS的培養(yǎng)液中培養(yǎng)16-18小時后， MⅡ期的卵母細(xì)胞進行體外受精，比較生發(fā)泡破裂(GVBD)、第一極體(PB1)排出及受精率、卵裂

10、率、囊胚形成率的差別。 結(jié)果：(1)HCG(+)組COC經(jīng)體外成熟培養(yǎng)14小時后，卵丘細(xì)胞團擴散比例明顯高于HCG(-)組(81.5％vs5.1％)。(2)HCG(+)組與HCG(-)桑椹胚形成率以及囊胚形成率存在非常明顯差異(P<0.01)。(3)FS可以顯著抑制EGF對PB1排出率的促進作用(P<0.01)但不能抑制EGF對胚胎發(fā)育的促進作用(P>0.05)。 結(jié)論：(1)LH峰后的數(shù)小時內(nèi)是卵母細(xì)胞成熟發(fā)育、維持核

11、漿成熟同步化的關(guān)鍵時期。(2)LH峰值前后ACTA/INHA對GV期卵母細(xì)胞體外成熟的影響不同，LH峰后ACTA/INHA對早期胚胎發(fā)育的促進作用消失。(3)胞核成熟與胞漿成熟存在不同的調(diào)控途徑；在核成熟的調(diào)控機理中，ACT系統(tǒng)是EGF的下游作用通路。 第三部分，卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系的安全性相關(guān)研究。 目的：通過對MⅠ期卵母細(xì)胞骨架的激光共聚焦研究探討體外成熟卵母細(xì)胞紡錘體、染色體結(jié)構(gòu)異常與非整倍體發(fā)生率的關(guān)系；通過

12、對MⅡ期卵母細(xì)胞染色體核型的檢測評價激活素A-抑制素A用于卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系的安全性。 方法：(1)GV期卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)7小時，獲取MⅠ期卵母細(xì)胞作為體外成熟組，體內(nèi)發(fā)育的MⅠ期卵母細(xì)胞作為對照組。經(jīng)免疫熒光染色，共聚焦熒光顯微鏡觀察紡錘體形態(tài)、染色體分布。(2)GV期卵母細(xì)胞隨機分入以下兩組：對照組采用HTF+10％SPS；試驗組采用100ng/mlACTA+INHA；體外培養(yǎng)16-18小時后，選擇MⅡ期卵母細(xì)胞進行染

13、色體核型分析。 結(jié)果：(1)體外成熟組紡錘體結(jié)構(gòu)異常以及染色體分布異常的比例均明顯增高(34.6％vs 7.1％：26.9％vs 0：P<0.01)。但成熟后的MⅡ期卵母細(xì)胞非整倍體發(fā)生率(0/31)并無增高。(2)ACTA+INHA組非整倍體發(fā)生率為7.1％，與對照組相比非整倍體發(fā)生率無顯著增高(P>0.05)。 結(jié)論：(1)不成熟卵體外培養(yǎng)過程中存在紡錘體結(jié)構(gòu)以及染色體分布的異常；卵母細(xì)胞可通過自檢方式阻止結(jié)構(gòu)異常的

14、細(xì)胞進一步分裂。(2)ACTA-INHA不增加體外成熟卵母細(xì)胞的非整倍體發(fā)生率。 激活素-抑制素-卵泡抑素系統(tǒng)在卵母細(xì)胞成熟過程中的影響機制相關(guān)研究在國內(nèi)尚無先例。國外的相關(guān)研究大多數(shù)限于對核成熟的調(diào)控作用方面，3篇關(guān)于牛的研究分別觀察了ACTA或INHA對胚胎發(fā)育潛能的影響，但結(jié)果不甚一致。本研究首次將ACT-INH-FS作為一個系統(tǒng)，較以往研究更為全面地探討其對卵母細(xì)胞成熟的調(diào)節(jié)機理，首次借助對卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察證實了其