GPR30介導(dǎo)的雌激素非經(jīng)典途徑在子宮腺肌病發(fā)病機制中的研究.pdf

1、子宮腺肌病(Adenomyosis，AM)是指具有生長功能的子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)侵入周圍子宮肌層而形成的局限性或彌漫性病變，主要臨床癥狀包括周期性和進行性加重的痛經(jīng)和經(jīng)量增多。盡管子宮腺肌病的病因和發(fā)病機制不清，但是多數(shù)學(xué)者認(rèn)為子宮基底層內(nèi)膜侵入肌層生長和高雌激素刺激密切相關(guān)，并涉及內(nèi)膜細(xì)胞生理、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等機制。
　　 雌激素膜受體GPR30(G protein-coupled estrogen receptor，GP

2、R30 or GPER-1)是一種7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，廣泛存在和表達(dá)于多種雌激素依賴性疾病。越來越多的研究表明GPR30在乳腺癌，子宮內(nèi)膜異位癥和子宮內(nèi)膜癌中可以參與調(diào)節(jié)雌激素介導(dǎo)的非基因組效應(yīng)。針對雌激素核受體nER的拮抗劑他莫昔芬及其代謝物4-羥基他莫昔芬可以通過結(jié)合激活細(xì)胞膜上的GPR30刺激ER陽性的人乳腺癌細(xì)胞和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞異常增殖和侵襲。微陣列芯片分析指出雌激素和4-羥基他莫昔芬也可以通過GPR30介導(dǎo)的快速基因組效應(yīng)

3、誘導(dǎo)和促進ER陰性的乳腺癌細(xì)胞的增生和遷移。已有研究表明，與非子宮腺肌病患者相比，子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜存在異常的細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲和細(xì)胞凋亡等細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，但具體機制不清。
　　 我們的研究發(fā)現(xiàn)，在子宮腺肌病患者的在位內(nèi)膜和異位病灶中的間質(zhì)和腺體細(xì)胞中存在GPR30的廣泛表達(dá)，GPR30蛋白和mRNA均呈過表達(dá)，且明顯高于對照組。第二部分中我們成功設(shè)計重組針對人GPR30的shRNA有效片段，包裝了高滴度的慢病毒載體;

4、并利用原代培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，成功建立慢病毒載體感染人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的條件參數(shù);并成功篩選出2條有效干擾人GPR30表達(dá)的shRNA序列。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，慢病毒GPR30 shRNA干擾子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞后，GPR30蛋白和信號通路蛋白pAkt/Akt表達(dá)均下調(diào);并抑制子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移能力;同時通過凋亡調(diào)節(jié)蛋白Caspase-3 Active/Pro比值、Bcl-2的表達(dá)上調(diào)和Bcl-x蛋白表達(dá)下調(diào)促進子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)

5、胞的凋亡。GPR30介導(dǎo)的雌激素非經(jīng)典途徑可能通過影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡參與該疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。
　　 第一部分子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜和異位病灶中雌激素膜受體GPR30的表達(dá)研究
　　 目的:
　　 研究雌激素膜受體GPR30在子宮腺肌病患者子宮在位內(nèi)膜和異位病灶的表達(dá)水平。
　　 方法:
　　 20例子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜和異位病灶，和20例非子宮腺肌病患者子宮在位內(nèi)膜標(biāo)本，免疫

6、組織化學(xué)法檢測在位內(nèi)膜和異位病灶中GPR30的定位和分布，Western blot和qPCR定量檢測GPR30蛋白和mRNA水平的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 GPR30廣泛分布于子宮內(nèi)膜間質(zhì)和上皮細(xì)胞，主要定位于細(xì)胞膜，部分細(xì)胞漿也有表達(dá)。與對照組的低表達(dá)相比，子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜高表達(dá)的GPR30有月經(jīng)周期差異，增生期高于分泌期;異位病灶GPR30的表達(dá)低于在位內(nèi)膜的表達(dá)，無月經(jīng)周期差異。子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜和

7、異位病灶上GPR30的蛋白和mRNA水平都高于非子宮腺肌病，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001，P＜0.001）。子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜和異位病灶之間GPR30蛋白和mRNA的表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001，P＜0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 1.GPR30廣泛分布于子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜和異位病灶的內(nèi)膜間質(zhì)和上皮細(xì)胞，主要定位于細(xì)胞膜，部分細(xì)胞漿也有表達(dá)。
　　 2.子宮腺肌病患者子宮在位內(nèi)膜和異位病灶GPR3

8、0的表達(dá)高于非子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜GPR30的表達(dá)。
　　 第二部分慢病毒介導(dǎo)的GPR30 shRNA干擾載體的構(gòu)建及有效干擾序列的篩選
　　 目的:
　　 設(shè)計構(gòu)建針對人GPR30干擾序列的慢病毒載體，利用體外培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞摸索最優(yōu)感染條件參數(shù)和篩選有效干擾效率的shRNA序列。
　　 方法:
　　 按照公用網(wǎng)站RNA干擾序列設(shè)計原則，設(shè)計特異性靶向人GPR30的4個最佳shRNA序

9、列及1個RNA干擾陰性對照Scramble序列，由上海吉凱基因技術(shù)有限公司合成。與mU6-MCS-Ubi-EGFP重組后，轉(zhuǎn)染大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。陽性克隆經(jīng)PCR鑒定及測序鑒定后，抽提質(zhì)粒后慢病毒包裝293T細(xì)胞，測定并標(biāo)定病毒滴度。以體外原代培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞為目的細(xì)胞，按照預(yù)實驗設(shè)計原則，熒光顯微鏡下直觀判斷感染效率，摸索出慢病毒最優(yōu)感染條件參數(shù)。通過PCR和qPCR檢測GPR30 mRNA表達(dá)水平，鑒定4個shRNA序列的干

10、擾效率。
　　 結(jié)果:
　　 抽提質(zhì)粒后測序提示插入的4個shRNA序列都正確，包裝的慢病毒液滴度測定結(jié)果分別是:8×108，5×108，8×108，8×108TU/mL。在添加ENi.S和Polybrene(5μg/mL)條件下，MOI值為50時慢病毒感染人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞8h，換液繼續(xù)培養(yǎng)72h后熒光顯微鏡下直觀判斷感染效率＞95％。感染72h后，通過PCR和qPCR檢測GPR30的mRNA表達(dá)水平明顯下降，4個sh

11、RNA序列的干擾效率分別為91.53％、81.72％、91.10％和40.65％。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功設(shè)計重組針對人GPR30的shRNA有效片段，并包裝了高滴度的慢病毒載體。
　　 2.成功建立慢病毒載體感染人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的感染條件參數(shù)。
　　 3.成功篩選出有效干擾人GPR30的shRNA序列。
　　 第三部分GPR30在子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖、遷移和凋亡中的作用
　　 目

12、的:
　　 慢病毒載體介導(dǎo)的GPR30 shRNA感染人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞后，研究GPR30在細(xì)胞增殖、遷移和凋亡中的作用。
　　 方法:
　　 體外分離培養(yǎng)子宮在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，慢病毒GPR30 shRNA感染干擾細(xì)胞，采用MTT/CCK8、劃痕試驗和Westem blot檢測GPR30和pAkt/Akt、及凋亡通路調(diào)節(jié)蛋白的變化，檢測感染后細(xì)胞的增殖能力、遷移能力和凋亡能力的變化。
　　 結(jié)果:

13、　　 子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞經(jīng)GPR30 shRNA干擾后連續(xù)5天吸光度值的增長水平一直明顯低于未干擾組和陰性序列對照組，顯示的增殖能力明顯下降。經(jīng)GPR30shRNA干擾后子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞遷移能力明顯下降，經(jīng)48h后劃痕仍未修復(fù)，而未干擾組和陰性序列對照組在劃痕12h后出現(xiàn)修復(fù)，24h可見劃痕距離明顯縮小，至48h后劃痕完全修復(fù)。GPR30 shRNA干擾細(xì)胞后，與未干擾組和陰性序列對照組相比，GPR30蛋白和信號通路蛋白pAkt/Akr

14、表達(dá)明顯下調(diào)，同時出現(xiàn)凋亡調(diào)節(jié)蛋白Caspase-3 Active/Pro比值和Bcl-2下調(diào)，和Bcl-x比值上調(diào)，而P53和PARP-1(cleaved p85)表達(dá)水平未見明顯變化。
　　 結(jié)論:
　　 1.慢病毒GPR30 shRNA干擾子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞后，GPR30蛋白和信號通路蛋白pAkt/Akt表達(dá)均明顯下調(diào)。
　　 2.慢病毒GPR30 shRNA干擾子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞后，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的增殖能力