IL-6在大鼠脊髓損傷后再生中的作用.pdf

1、成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，軸突再生非常困難。其主要原因是因?yàn)閾p傷神經(jīng)元內(nèi)在再生能力的低下以及抑制性損傷微環(huán)境即髓鞘相關(guān)的再生抑制因子的存在和膠質(zhì)瘢痕的形成。中和抑制分子的作用、阻斷抑制信號的傳導(dǎo)通路以及增強(qiáng)神經(jīng)元內(nèi)在生長狀態(tài)，從而誘導(dǎo)再生，是目前促進(jìn)中樞神經(jīng)再生的主要策略之一。
　　近來研究表明，神經(jīng)元內(nèi)cAMP水平隨著發(fā)育過程逐漸降低是成年動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生能力低下的主要原因。提高成年神經(jīng)元內(nèi)cAMP水平，可提高其內(nèi)在的

2、再生能力。進(jìn)一步分析cAMP提高神經(jīng)元內(nèi)在生長狀態(tài)的基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在11個表達(dá)上調(diào)的基因中，IL-6升高最顯著。
　　作為中樞神經(jīng)損傷前炎性因子，IL-6參與炎性反應(yīng)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)繼發(fā)性損害。但近年來研究表明，IL-6在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中同時扮演了“雙刃劍”角色。 IL-6在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中可以促進(jìn)軸突芽生，在再生中起積極作用，有望為CNS損傷能后修復(fù)提供新的藥物治療靶點(diǎn)。
　　目的：
　　通過建立大鼠脊髓損傷

3、模型，離體培養(yǎng)DRG神經(jīng)元及脊髓蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-6，研究IL-6對DRG神經(jīng)元及脊髓再生的影響及其機(jī)制。
　　方法：
　　IL-6誘導(dǎo)大鼠DRG神經(jīng)元突起生長的離體實(shí)驗(yàn)研究：培養(yǎng)成年大鼠DRG神經(jīng)元，細(xì)胞分五組：空白對照組、髓鞘蛋白對照組（2μg/well）和IL-6干預(yù)組（均含髓鞘蛋白2μg/well），IL-6干預(yù)組按終濃度分為50、100和200ng/ml三個亞組。采用四甲基偶氮唑鹽光吸收法（MTT法）檢測IL-6

4、對細(xì)胞活性的影響；觀察DRG神經(jīng)元的生長狀態(tài)；測量DRG神經(jīng)元突起長度。
　　IL-6對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)再生的影響：建立脊髓損傷模型；經(jīng)枕骨大孔插管，脊髓蛛網(wǎng)膜下腔給藥，BDA示蹤皮質(zhì)脊髓束。BBB評分觀察造模后不同時點(diǎn)各組大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)狀況，DAB顯色觀察IL-6促神經(jīng)再生；測量DAB染色陽性神經(jīng)纖維的平均面密度。
　　IL-6促進(jìn)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)再生的機(jī)制探討：細(xì)胞免疫化學(xué)、激光共聚焦技術(shù)檢測DRG神經(jīng)元細(xì)胞中GA

5、P-43表達(dá)；免疫熒光技術(shù)分析各實(shí)驗(yàn)組動物損傷段脊髓組織GAP-43、Nogo-A和NgR蛋白表達(dá)；RT-PCR分析IL-6對DRG神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)GAP-43mRNA、Nogo-AmRNA及NgR mRNA表達(dá)水平的影響；RT-PCR分析IL-6對損傷段脊髓組織GAP-43mRNA、Nogo-AmRNA和NgRmRNA表達(dá)水平的影響；Western Blot分析方法檢測各實(shí)驗(yàn)組動物損傷段脊髓組織GAP-43、Nogo-A和NgR蛋白表達(dá)。

6、
　　結(jié)果：
　　IL-6誘導(dǎo)大鼠DRG神經(jīng)元突起生長的離體實(shí)驗(yàn)研究：同對照組比較，髓鞘蛋白影響離體培養(yǎng)DRG神經(jīng)元生存活性，IL-6各濃度組均不影響DRG神經(jīng)元生存活性；髓鞘蛋白組DRG神經(jīng)元突起生長明顯受抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各IL-6組均可以克服髓鞘蛋白對DRG神經(jīng)元突起再生的抑制作用，促進(jìn)突起生長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），且IL-6中、高濃度組與低濃度組有顯著性差異；中、高濃度IL-6可

7、以完全對抗髓鞘蛋白對DRG神經(jīng)元突起再生的抑制作用，與對照組比，突起長度無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　IL-6對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)再生的影響：不同劑量的IL-6經(jīng)脊髓蛛網(wǎng)膜下腔給藥均能改善脊髓損傷后大鼠下肢BBB評分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；IL-6(50pmol/kg.d)經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔給藥后損傷部位DAB染色陽性纖維明顯增多，神經(jīng)軸突大量芽生，部分再生神經(jīng)纖維的芽枝繞過、穿越損傷部位，進(jìn)入尾側(cè)端脊髓。IL-6治

8、療組DAB染色陽性神經(jīng)纖維平均面密度較對照組明顯升高（P＜0.05）。
　　IL-6促進(jìn)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)再生的機(jī)制探討：細(xì)胞免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)同對照組比較，各IL-6干預(yù)組DRG神經(jīng)元GAP-43蛋白表達(dá)增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；IL-6上調(diào)損傷段脊髓組織中GAP-43蛋白的表達(dá)，同時下調(diào)Nogo-A和NgR蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；IL-6上調(diào)DRG元細(xì)胞及脊髓組織GAP-43mRN

9、A表達(dá)，同時下調(diào)DRG元細(xì)胞及脊髓組織Nogo-AmRNA和NgRmRNA的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.不同濃度IL-6對神經(jīng)元生存活性無影響。髓鞘蛋白影響DRG神經(jīng)元的生存活性，而且抑制神經(jīng)元突起生長；IL-6可以對抗髓鞘蛋白對DRG神經(jīng)元的抑制作用，促進(jìn)離體培養(yǎng)DRG神經(jīng)元突起生長，且呈劑量依賴關(guān)系。100ng/ml及以上濃度的IL-6可以完全對抗髓鞘蛋白對DRG神經(jīng)元的抑制作用。