脊髓康對大鼠脊髓損傷后軸突再生微環(huán)境的作用機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　研究發(fā)現(xiàn)，SCI后神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏、髓鞘相關(guān)抑制分子的產(chǎn)生等是影響軸突再生微環(huán)境的重要原因。中醫(yī)藥以其多因素、多靶點的優(yōu)點，正逐步成為改善神經(jīng)再生微環(huán)境的研究熱點?！凹顾杩怠笔俏覀冊谥嗅t(yī)“腎督同治”理論指導(dǎo)下，結(jié)合多年的臨床實踐而形成的驗方，具有“祛瘀通督，滋補(bǔ)肝腎，調(diào)和氣血”之功效，前期的臨床及初步實驗研究證實，脊髓康可促進(jìn)SCI患者神經(jīng)功能恢復(fù)，抑制脂質(zhì)過氧化，清除氧自由基，改善損傷局部微環(huán)境，我們推測“脊髓康”這

2、一效應(yīng)可能與其促進(jìn)相關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)、抑制髓鞘相關(guān)抑制分子等作用關(guān)聯(lián)。
　　目的:
　　進(jìn)一步明確中藥“脊髓康”對SCI后神經(jīng)功能恢復(fù)及脊髓組織病理改變的影響，探討“脊髓康”對BDNF、NGF及NgR神經(jīng)再生相關(guān)調(diào)控因子及受體表達(dá)的影響，分析“脊髓康”改善損傷軸突再生微環(huán)境的可能作用機(jī)制。
　　方法:
　　清潔級SD大鼠210只，雌性，體重180～220g，30只用于SCI動物模型的評價，180只用于正式實驗。

3、運(yùn)用改良Allen's法建立大鼠的脊髓損傷動物模型。假手術(shù)組僅單純咬除T9～T11段椎板、棘突。隨機(jī)抽取30只大鼠作為假手術(shù)組，其余150只大鼠造模成功后隨機(jī)分為5組，即模型組、強(qiáng)的松組、脊髓康高劑量組、脊髓康中劑量組、脊髓康低劑量組，每組30只。各組大鼠均于麻醉蘇醒后30min即開始給予處理，強(qiáng)的松組給藥0.06g/(kg.d)，脊髓康中劑量組給藥25g/(kg.d)，高劑量組給藥50g/(kg.d)，低劑量組給藥12.5g/(kg.

4、d)。各組均按體積20ml/(kg.d)灌胃給藥。假手術(shù)組和模型組均灌胃以同等劑量的生理鹽水。分別于術(shù)后24h、3d、7d、14d，對各組大鼠進(jìn)行BBB評分、斜板試驗，干預(yù)后3d、7d、14d處死大鼠取脊髓組織樣本，HE染色、透射電鏡觀察各組脊髓組織結(jié)構(gòu)的變化，ELISA法分析大鼠SCI后血清BDNF、NGF的表達(dá)情況，免疫組化、western blot、熒光定量PCR法檢測大鼠SCI后脊髓損傷區(qū)BDNF、NGF及NgR蛋白、mRNA的

5、表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　(1)術(shù)后不同時間點BBB評分及斜板試驗比較，模型組均顯著低于假手術(shù)組(P＜0.01)。 HE染色顯示正常對照組、假手術(shù)組脊髓組織結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)元未見胞體腫脹、胞核固縮、壞死等病理改變，間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤，而模型組脊髓組織結(jié)構(gòu)破壞，神經(jīng)纖維排列紊亂，可見神經(jīng)元固縮、壞死、溶解，出現(xiàn)片狀出血灶。
　　(2)術(shù)后24h各組大鼠BBB評分、斜板試驗角度顯著低于假手術(shù)組(P＜0.01)。術(shù)后3d～1

6、4d脊髓康中劑量組與強(qiáng)的松組行為學(xué)評分均高于模型組(P＜0.05)，而兩組間比較無明顯差異(P＞0.05)，術(shù)后7d各治療組大鼠的后肢活動改善均較為明顯，但脊髓康中劑量組與強(qiáng)的松組未見明顯差異(P＞0.05)，術(shù)后14d脊髓康中劑量組BBB評分顯著高于其他各組，與強(qiáng)的松組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　(3) HE染色顯示:模型組脊髓組織結(jié)構(gòu)破壞，組織疏松，神經(jīng)纖維間隙重度增大，可見神經(jīng)元固縮、壞死、溶解，并呈進(jìn)行性

7、加重，強(qiáng)的松組及脊髓康各治療組也見脊髓結(jié)構(gòu)破壞，部分神經(jīng)元固縮、壞死、溶解，但隨著干預(yù)時間延長，神經(jīng)元存活較模型組明顯，神經(jīng)元水腫、壞死情況較輕，尤以強(qiáng)的松組、脊髓康中劑量組脊髓組織改善較為明顯;透射電鏡結(jié)果表明，模型組傷后3d到7d內(nèi)病變呈進(jìn)行性加重，少部分發(fā)生不可逆性的損害，強(qiáng)的松組及脊髓康組亦可見髓鞘變性，板層分離，部分軸突水腫、凝固變性，部分軸索內(nèi)可見線粒體，但結(jié)構(gòu)較為清晰。
　　(4) ELISA結(jié)果顯示，SCI后大鼠血

8、清BDNF、NGF都有不同程度的升高，但維持時間較短。術(shù)后3d各組BDNF、NGF均較假手術(shù)組有顯著升高，術(shù)后7d～14dBDNF仍維持在較高水平，而NGF的表達(dá)水平略有下降。各時間點統(tǒng)計結(jié)果顯示，強(qiáng)的松、脊髓康均能有效促進(jìn)SCI后血清BDNF、NGF的表達(dá)，并維持在較高水平，術(shù)后7d～14d強(qiáng)的松組與脊髓康中劑量組相比未見明顯差異(P＞0.05)。
　　(5)免疫組化及Western Blot顯示，大鼠SCI后脊髓損傷區(qū)BDNF

9、、NGF都有不同程度的升高，與ELISA結(jié)果一致。不同時間點強(qiáng)的松組及脊髓康組BDNF、NGF表達(dá)水平較模型組均有顯著升高，其中BDNF術(shù)后7d～14d仍維持在較高水平，而NGF的表達(dá)水平7d后均略有下降。大鼠SCI后脊髓損傷區(qū)高度表達(dá)NgR，而強(qiáng)的松、脊髓康可有效抑制脊髓損傷區(qū)NgR蛋白的表達(dá)，不同時間點比較，均較模型組顯著降低(P＜0.05)。
　　(6)熒光定量PCR顯示，強(qiáng)的松、脊髓康可促進(jìn)SCI后脊髓損傷區(qū)BDNF、NG

10、FmRNA的表達(dá)，抑制NgRmRNA的表達(dá)。SCI后早期，強(qiáng)的松效果較為明顯，脊髓康的治療效應(yīng)亦明顯優(yōu)于模型組，且中劑量組效應(yīng)最佳，但與強(qiáng)的松組相比，作用緩慢，而干預(yù)后14d，脊髓康中劑量組BDNF、NGFmRNA仍可維持在較高水平，同時NgRmRNA表達(dá)水平較低。
　　結(jié)論:
　　(1)本研究采取的大鼠改良Allen's造模方法可行，穩(wěn)定性好，易于復(fù)制。
　　(2)強(qiáng)的松、脊髓康均可促進(jìn)大鼠SCI后后肢運(yùn)動功能的恢復(fù)

11、，干預(yù)7d后中藥的整體調(diào)節(jié)作用更為顯著。
　　(3)強(qiáng)的松、脊髓康均可較好地減輕和延緩脊髓損傷后的病理損害程度，阻止不可逆性的變性現(xiàn)象的發(fā)生和發(fā)展。
　　(4)強(qiáng)的松、脊髓康均可促進(jìn)SCI后血清及髓內(nèi)BDNF、NGF蛋白及mRNA的表達(dá)，抑制NgR蛋白及mRNA的產(chǎn)生，且強(qiáng)的松在SCI早期效應(yīng)較為明顯，而中藥脊髓康藥效作用持久，長時間仍可維持有效效應(yīng)濃度，提示脊髓康在SCI后中晚期的整體調(diào)節(jié)作用優(yōu)勢明顯，這可能是中藥脊髓康促