表皮生長因子受體抑制劑對(duì)大鼠脊髓損傷后軸突再生微環(huán)境的作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分表皮生長因子受體抑制劑AG1478對(duì)大鼠脊髓損傷后GAP-43的表達(dá)及運(yùn)動(dòng)功能缺損的影響
　　目的：脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕的形成及髓鞘相關(guān)抑制分子的產(chǎn)生是導(dǎo)致軸突不能有效再生的重要原因。而表皮生長因子受體的活化可導(dǎo)致靜息星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生并形成膠質(zhì)瘢痕，而且表皮生長因子受體抑制劑AG1478通過減輕髓鞘相關(guān)抑制分子及硫酸軟骨素蛋白聚糖對(duì)軸突再生的抑制作用而促進(jìn)了視神經(jīng)軸突的再生，因此表皮生長因子受體抑制劑AG1478可能

2、對(duì)脊髓損傷后軸突的再生有促進(jìn)作用而改善脊髓損傷所導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺損。在本實(shí)驗(yàn)中我們通過在損傷脊髓局部給予表皮生長因子受體抑制劑AG1478以觀察AG1478能否上調(diào)相關(guān)生長蛋白-43（GAP-43）的表達(dá)及其是否改善大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能缺損癥狀。
　　 方法：應(yīng)用重物墜落打擊法建立大鼠脊髓損傷模型, 假手術(shù)組僅切除T10椎板。48只健康雌性成年SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、損傷對(duì)照組和AG1478治療組。AG1478治療組大鼠在脊

3、髓損傷后立即在局部給予含有0.2 ml 2mM的AG1478的明膠海綿外敷治療，而損傷對(duì)照組和假手術(shù)均在術(shù)后立即給予含溶劑（二甲基亞砜）的明膠海綿外敷作對(duì)照治療。應(yīng)用免疫熒光技術(shù)和western blot檢測(cè)各組大鼠脊髓損傷后28天損傷區(qū)域生長相關(guān)蛋白-43(GAP-43)的表達(dá)情況。應(yīng)用BBB評(píng)分法對(duì)大鼠脊髓損傷后第1d及以后每周（共8周）后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分。在損傷前及損傷后每周（共8周）測(cè)量各組大鼠體重。
　　 結(jié)果：免疫

4、熒光檢測(cè)顯示在損傷后28天AG1478組GAP-43陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)表達(dá)較對(duì)照組明顯增多(P＜0.01)。Western blot印跡分析也顯示AG1478組GAP-43表達(dá)較對(duì)照組明顯上調(diào)(P＜0.01)。損傷對(duì)照組與AG1478治療組大鼠在傷后第1天后肢均幾乎完全癱瘓,表明兩組大鼠損傷程度一致。經(jīng)重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析檢驗(yàn)后顯示AG1478組BBB評(píng)分明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。經(jīng)重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差檢驗(yàn)分析顯示AG1478組大鼠體重明顯

5、重于對(duì)照組大鼠體重(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：脊髓損傷后立即在損傷局部給予表皮生長因子受體抑制劑AG1478干預(yù)，可以改善大鼠脊髓損傷后的神經(jīng)功能缺損并明顯上調(diào)與軸突生長相關(guān)的GAP-43。表皮生長因子受體抑制劑AG1478對(duì)脊髓損傷有確切的治療作用，這提示其可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的有效保護(hù)劑。
　　 第二部分表皮生長因子受體抑制劑AG1478對(duì)大鼠脊髓損傷后反應(yīng)性星形膠質(zhì)活化增生的影響
　　 目的：星形膠質(zhì)

6、增生被認(rèn)為在脊髓損傷的病理生理改變中起著極其重要的作用，而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的病理生理改變中星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生與表皮生長因子受體的活化密切相關(guān)。因此我們?cè)噲D應(yīng)用表皮生長因子受體抑制劑AG1478對(duì)脊髓損傷進(jìn)行干預(yù)以觀察表皮生長因子受體抑制劑AG1478對(duì)脊髓損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞上磷酸化表皮生長因子受體（Pegfr）的表達(dá)和反應(yīng)性膠質(zhì)增生及軸突生長抑制因子硫酸軟骨素蛋白聚糖（CSPGs）產(chǎn)生的影響方法：應(yīng)用重物墜落打擊法建立大鼠脊髓損傷模型

7、, 假手術(shù)組僅切除T10椎板。45只健康雌性成年SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、損傷對(duì)照組和AG1478治療組。AG1478治療組大鼠在脊髓損傷后立即在局部給予含有0.2 ml 2mM的AG1478的明膠海綿外敷治療，而損傷對(duì)照組和假手術(shù)均在術(shù)后立即給予含溶劑（二甲基亞砜）的明膠海綿外敷作對(duì)照治療。分別于損傷后14d、28d處死各組實(shí)驗(yàn)大鼠。應(yīng)用免疫熒光技術(shù)和western blot技術(shù)檢測(cè)GFAP在損傷后14天、28天的表達(dá)水平變化情況；采

8、用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)脊髓損傷后14天各組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)磷酸化表皮生長因子受體（Pegfr）的情況并檢測(cè)傷后28天時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)硫酸軟骨素蛋白聚糖（CSPGs）的情況。
　　 結(jié)果：假手術(shù)組GFAP陽性細(xì)胞稀少，形態(tài)纖細(xì)；而損傷對(duì)照組在傷后14天GFAP表達(dá)明顯上調(diào)，星形膠質(zhì)細(xì)胞呈突觸增多變大的活化狀態(tài)，傷后28天典型膠質(zhì)瘢痕出現(xiàn)；在AG1478治療組GFAP的表達(dá)明顯受到抑制，而傷后28天無明顯膠質(zhì)瘢痕形成。GFAP

9、 Western印跡分析也顯示在損傷后14天和28天，AG1478組GFAP的表達(dá)均明顯低于對(duì)照組假手術(shù)組(P＜0.01)。假手術(shù)組Pegfr和GFAP表達(dá)均很弱，無熒光染色雙標(biāo)陽性區(qū)域，表明正常脊髓組織的星形膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)Pegfr。對(duì)照組Pegfr和GFAP均有強(qiáng)表達(dá)，同時(shí)損傷組脊髓組織病灶周圍存在明顯空洞和疤痕改變，且在空洞周圍疤痕存在Pegfr和GFAP雙標(biāo)陽性區(qū)域，表明脊髓損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Pegfr，然而AG1478組P

10、egfr和GFAP的表達(dá)均較弱，其熒光強(qiáng)度較對(duì)照組明顯較弱（P＜0.01），且無Pegfr和GFAP雙標(biāo)陽性區(qū)域,表明AG1478對(duì)Pegfr和GFAP的表達(dá)均有明顯抑制作用。假手術(shù)組脊髓組織CSPGs和GFAP表達(dá)均較弱；而對(duì)照組CSPGs和GFAP均有較強(qiáng)表達(dá)，且損傷中心CSPGs表達(dá)很強(qiáng)，在膠質(zhì)瘢痕區(qū)域CSPGs和GFAP存在明顯雙標(biāo)陽性區(qū)域，表明活化星形膠質(zhì)細(xì)胞大量表達(dá)CSPGs；在AG1478組脊髓組織中CSPGs和GFAP的

11、熒光強(qiáng)度均明顯低于照組（P＜0.01），這表明AG1478能明顯抑制CSPGs和GFAP的表達(dá)。
　　 結(jié)論：脊髓損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯上調(diào)Pegfr的表達(dá)，而表皮生長因子受體抑制劑AG1478通過對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞上Pegfr活化的抑制而導(dǎo)致其對(duì)脊髓損傷后反應(yīng)性星形膠質(zhì)增生及抑制因子CSPGs有明顯抑制作用。
　　 第三部分表皮生長因子受體抑制劑AG1478對(duì)大鼠脊髓損傷后髓鞘脫失及髓鞘相關(guān)抑制因子表達(dá)的影響
　　

12、 目的：外傷性脊髓損傷不僅造成神經(jīng)元及軸突嚴(yán)重?fù)p傷而且導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞受到嚴(yán)重傷害，而少突膠質(zhì)細(xì)胞和軸突損害最終導(dǎo)致脊髓髓鞘的大量脫失。同時(shí)少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷后會(huì)釋放大量髓鞘相關(guān)抑制分子，這些抑制分子對(duì)脊髓損傷后軸突的再生產(chǎn)生極其不利的影響。而表皮生長因子受體抑制劑AG1478對(duì)脊髓損傷有良好的治療作用，故我們?cè)噲D應(yīng)用表皮生長因子受體抑制劑AG1478干預(yù)脊髓損傷以觀察AG1478對(duì)大鼠脊髓損傷后髓鞘脫失及髓鞘相關(guān)抑制因子MAG、Nogo

13、-A和Omgp Mrna表達(dá)的影響。
　　 方法：將33只健康雌性成年SD大鼠隨機(jī)分為損傷對(duì)照組（重物墜落打擊法建立脊髓損傷模型后立即在損傷局部給予含二甲基亞砜的明膠海綿外敷作對(duì)照治療），AG1478治療組（重物墜落打擊法建立模型后立即在損傷局部給予含有0.2 ml 2mM的AG1478的明膠海綿外敷治療）和假手術(shù)組（只切除椎板并立即在損傷局部給予含二甲基亞砜的明膠海綿外敷作對(duì)照治療）。各組大鼠均在脊髓損傷后14和28天處死。應(yīng)

14、用勒克司堅(jiān)牢藍(lán)染色（Luxol Fast Blue）方法分析各組大鼠脊髓損傷后28天髓鞘脫失情況。利用RT-PCR方法檢測(cè)各組大鼠脊髓損傷后14天、28天髓鞘相關(guān)抑制因子MAG、Nogo-A和Omgp Mrna表達(dá)的情況。
　　 結(jié)果：在假手術(shù)組大鼠脊髓切片Luxol Fast Blue 染色中，脊髓組織呈均勻的亮藍(lán)色；而在對(duì)照組中損傷部位不能正常著色，這提示病灶中心髓鞘嚴(yán)重脫失；而在AG1478治療組中脊髓組織切片不能正常著色

15、的范圍明顯縮小，其髓鞘脫失面積明顯小于對(duì)照組（P＜0.01）。而髓鞘相關(guān)抑制分子MAG、Nogo-A和Omgp Mrna在假手術(shù)組有較弱的表達(dá)；在損傷對(duì)照組，脊髓損傷后14天及28天髓鞘相關(guān)抑制分子的表達(dá)均明顯增加；而在AG1478組，脊髓損傷后14天及28天髓鞘相關(guān)抑制分子的表達(dá)均明顯低于對(duì)照組（P<0.01)。
　　 結(jié)論：局部應(yīng)用表皮生長因子受體抑制劑AG1478可改善大鼠脊髓損傷后髓鞘的脫失并能減少大鼠脊髓損傷后髓鞘相關(guān)