非小細(xì)胞肺癌對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑繼發(fā)耐藥的機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：非小細(xì)胞肺癌（Non—small cell lung cancer，NSCLC）位居癌癥死亡的首位，在發(fā)達(dá)國家的5年生存率約15％，發(fā)展中國家的5年生存率約9％。表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR TKI）是繼手術(shù)、放療和化療之后出現(xiàn)的又一治療手段。EGFR TKI對(duì)部分NSCLC十分有效，但這部分病

2、例最終都會(huì)出現(xiàn)繼發(fā)耐藥。明確的耐藥機(jī)制仍未闡明。本研究為了探討中國NSCLC人群對(duì)EGFR TKI的耐藥機(jī)制，對(duì)EGFR、KRAS、c—MET以及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Hepatocyte growth factor，HGF）等四個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行研究，分析它們的特點(diǎn)與在耐藥中的意義。 材料與方法：以沒有TKI治療過的NSCLC手術(shù)后病例作為基線人群，對(duì)一組共31例EGFR TKI治療耐藥后的NSCLC進(jìn)行研究。分別用直接測(cè)序法（Direct

3、 sequencing）與蝎形探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（Scorpions amplification refractory mutation system，ARMS）檢測(cè)EGFR基因酪氨酸激酶區(qū)（18～21外顯子）的敏感突變及耐藥突變，分析突變與療效預(yù)后的關(guān)系；用Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0 Array基因芯片比較3例含T790M突變NSCLC與6例EGFR敏感突變NSCLC之間的全基因組表達(dá)變

4、化；用直接測(cè)序法與KRAS突變?cè)噭┖校↘RAS mutation test kit）檢測(cè)KRAS基因第12、13、59和61位密碼子的突變；用實(shí)時(shí)熒光定量PCR TaqMan探針法檢測(cè)c—MET基因的拷貝數(shù)；用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測(cè)HGF對(duì)Gefitinib細(xì)胞毒作用的影響；用免疫組化方法檢測(cè)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子在耐藥后NSCLC中的表達(dá)水平。 結(jié)果：在耐藥病例中直接測(cè)序法共檢測(cè)到48.4％有EGFR敏感突變（15/31）與2

5、5.8％有T790M突變（8/31）。ARMS方法檢測(cè)出85.7％有敏感突變（24/28），51.6％有T790M突變（16/31）。兩種方法在EGFR敏感突變檢出率上差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fisher精確概率法，P=0.0029）；在檢測(cè)T790M突變時(shí)ARMS方法也比直接測(cè)序法敏感（卡方檢驗(yàn)，P=0.037）。所有T790M突變都在耐藥后的標(biāo)本中檢出，其中1例為單獨(dú)存在的T790M突變。EGFR敏感突變豐度高的病例（僅在直接測(cè)序法檢測(cè)到

6、）對(duì)TKI的無進(jìn)展生存期（Progression free survival，PFS）長(zhǎng)于敏感突變豐度低的病例（直接測(cè)序未能檢出，但被ARMS法檢出）（P=0.012）。與高豐度T790M突變的病例相比，低豐度T790M突變的PFS較短（P=0.0028）。 EGFR T790M突變與敏感突變之間的全基因組表達(dá)差異主要有細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖與腫瘤轉(zhuǎn)移三個(gè)方面，包括XAF1、BCL2、BCL2L12、HSP60、HSP10、ADA

7、M9與MET等基因。在沒有TKI治療過的NSCLC病例中KRAS基因突變率為7.6％（10/132），在吸煙人群中突變率高于非吸煙者。在TKI耐藥后NSCLC中，直接測(cè)序法與ARMS方法均未發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變。 在基線人群中3.8％（2/53）有c—Met基因擴(kuò)增；耐藥后的NSCLC中16.1％（5/31）有c—Met基因擴(kuò)增。兩組之間差異接近有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fisher精確概率法，P=0.095）。治療前或治療后檢出的c—Me

8、t基因擴(kuò)增在臨床病理因素方面沒有明顯差異。c—Met基因擴(kuò)增在EGFR敏感突變或野生型NSCLC中均可出現(xiàn)，有2份耐藥后的標(biāo)本被證實(shí)c—Met基因擴(kuò)增合并EGFR T790M突變。 外源性HGF沒有影響Gefitinib對(duì)EGFR野生型NSCLC細(xì)胞的殺傷作用。17.4％（4/23）耐藥后NSCLC為HGF陽性表達(dá)。陽性病例均為EGFR19外顯子缺失突變NSCLC，其中3例同時(shí)合并T790M突變。HGF高表達(dá)的病例沒有合并c—M

9、et基因擴(kuò)增。所有HGF陽性病例對(duì)TKI耐藥后的進(jìn)一步治療均無反應(yīng)。 結(jié)論： 1、51.6％（ARMS法）對(duì)TKI耐藥的中國非小細(xì)胞肺癌與繼發(fā)EGFR T790M突變有關(guān)。 2、繼發(fā)性EGFR T790M突變可能獨(dú)立于敏感突變而存在。 3、EGFR基因突變豐度不同的NSCLC其無進(jìn)展生存期不同。 4、EGFR T790M突變引起與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子出現(xiàn)變化。 5、中國NSC