IL-6在小鼠急性肝損傷后的肝細(xì)胞再生中的相關(guān)研究.pdf

1、目的：通過小鼠肝部分切除術(shù)建立小鼠急性肝損傷的動(dòng)物模型，觀察不同時(shí)間點(diǎn)肝損傷及肝再生的變化，探討白介素-6(IL-6)在小鼠急性肝損傷后肝再生過程中可能的作用。
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)方法：SPF級(jí)健康雄性6-8周齡C57b1/j6小鼠及SPF級(jí)健康雄性IL-6基因敲除C57b/j6小鼠(均購于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所)體重18-28g，飼養(yǎng)于東南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由飲水，隨意進(jìn)食，12小時(shí)交替照明。將小鼠分為對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組(IL

2、-6基因敲除小鼠)，取5只小鼠作為空白對(duì)照組用以測(cè)量小鼠正常肝重/體重比、各肝葉所占比例及小鼠血清ALT、AST、GGT、AKP、Glu正常值范圍，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組每組小鼠25只，每組小鼠分為6h，12h，24h，36h及48h5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只小鼠，稱小鼠術(shù)前及術(shù)后體重，分別于上午8:00-11:00予以1％戊巴比妥40mg/kg腹腔注射麻醉后參照Higgins，Anderson[1]和湯朝暉，吳孟超[2]等及Mehrdad N

3、ikfarjam[3]的方法，切除小鼠肝臟約70％，建立模型成功后，稱切除肝臟濕重，并分別于術(shù)后6h，12h，24h，36h及48h予以1％戊巴比妥40mg/kg腹腔注射麻醉，1ml空針下腔靜脈采血0.8ml，室溫靜置30min后4000 r/min離心5min，離心后留取血清檢測(cè)各組術(shù)后AST、ALT、AKP、GGT、Glu的變化，并迅速切取殘肝稱肝臟濕重后福爾馬林固定，計(jì)算肝再生率及肝臟指數(shù)，并取肝臟組織進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色

4、，研究肝再生過程中肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。每個(gè)樣本隨機(jī)取高倍鏡下10個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野下100個(gè)細(xì)胞中處于有絲分裂狀態(tài)細(xì)胞或雙核細(xì)胞所占比率，以增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的免疫組織化學(xué)染色作為肝再生的指標(biāo)，高倍鏡下，每張切片隨機(jī)取高倍鏡下10個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)高倍鏡下100個(gè)肝細(xì)胞中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞核呈棕色(無論其深淺)均視為陽性肝細(xì)胞。PCNA標(biāo)記指數(shù)=PCNA陽性肝細(xì)胞數(shù)/1000x100％。Caspase-3免疫組化染色在高

5、倍鏡下(10×40)隨機(jī)觀察5個(gè)視野，胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色者為陽性細(xì)胞，計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野下陽性細(xì)胞數(shù)。
　　 結(jié)果：
　　 HE染色：成功建立小鼠肝部分切除肝臟急性損傷模型后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組術(shù)后肝組織均明顯增生，HE染色光鏡觀察示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組術(shù)前肝組織切片蘇木素-伊紅(HE)染色顯示，術(shù)前正常肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索呈放射狀排列，肝血竇清晰，肝切除術(shù)后與術(shù)前比較，可見明顯的組織增生，細(xì)胞體積變大，增生的肝細(xì)胞索排列結(jié)構(gòu)有不

6、同程度紊亂，且雙核細(xì)胞數(shù)目有明顯增加，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組術(shù)后肝組織切片HE染色雙核細(xì)胞計(jì)數(shù)較術(shù)前升高，對(duì)照組升高較實(shí)驗(yàn)組升高明顯，對(duì)照組術(shù)后12h、24h、36h、48h較術(shù)前升高明顯，有明顯差異(P<0.05)；術(shù)后6h較術(shù)前升高不明顯，無明顯差異(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組術(shù)后24h、36h、48h較術(shù)前升高明顯，有明顯差異(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，對(duì)照組術(shù)后12h、24h、36h各時(shí)間點(diǎn)雙核細(xì)胞計(jì)數(shù)較實(shí)驗(yàn)組雙核細(xì)胞升高明顯，有

7、明顯差異(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，對(duì)照組術(shù)后48h雙核細(xì)胞計(jì)數(shù)較實(shí)驗(yàn)組雙核細(xì)胞升高明顯，有明顯差異(P<0.05)。術(shù)后6h兩組之間雙核細(xì)胞數(shù)目比較無明顯差異(P>0.05)。
　　 肝再生率及肝臟指數(shù)：各組之間術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)小鼠肝臟指數(shù)均小于正常組，有明顯差異(P<0.01)，術(shù)后6h及術(shù)后12h實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間小鼠肝臟指數(shù)無明顯差異(P>0.05)，術(shù)后24h、36h實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟指數(shù)小于對(duì)照組，有明顯差異(P<

8、0.05)，術(shù)后48h實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟指數(shù)小于對(duì)照組，有明顯差異(P<0.01)。術(shù)后6h、12h實(shí)驗(yàn)組肝再生率均低于對(duì)照組，有明顯差異(P<0.05)；術(shù)后24h、36h實(shí)驗(yàn)組肝再生率均低于對(duì)照組，有明顯差異(P<0.01)；術(shù)后48h實(shí)驗(yàn)組肝再生率均低于對(duì)照組，兩組間無明顯差異(P>0.05)。
　　 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果：術(shù)后血清中ALT、AST含量較術(shù)前明顯升高，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組ALT均于術(shù)后12h達(dá)到高峰，然后開始下降，實(shí)驗(yàn)組A

9、LT下降較對(duì)照組緩慢；對(duì)照組AST于術(shù)后12h達(dá)到高峰后開始緩慢下降，而實(shí)驗(yàn)組AST于術(shù)后24h達(dá)到高峰，且峰值較對(duì)照組大；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)血清中AST、ALT的含量較術(shù)前有明顯升高，有明顯差異(P<0.01)；術(shù)后36h實(shí)驗(yàn)組血清中ALT含量高于對(duì)照組，有明顯差異(P<0.01)；術(shù)后48h實(shí)驗(yàn)組血清中ALT含量高于對(duì)照組，有明顯差異(P<0.05)；術(shù)后12h、36h、48h實(shí)驗(yàn)組血清中AST含量高于對(duì)照組，有明顯差異(P

10、<0.05)；術(shù)后24h實(shí)驗(yàn)組血清中AST含量高于對(duì)照組，有明顯差異(P<0.01)。小鼠肝部分切除術(shù)后血清中AKP、GGT。含量較術(shù)前明顯升高。均于術(shù)后24h達(dá)到高峰，組間比較無明顯差異。術(shù)后6h、12h、24h、36h、48h血清中AKP、GGT較術(shù)前升高，有明顯差異(P<0.05)。小鼠肝部分切除術(shù)后血清中G1u水平較術(shù)前下降，與術(shù)前相比較有明顯差異(P<0.05)。
　　 免疫組織化學(xué)染色：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠肝部分切除術(shù)

11、后各時(shí)間點(diǎn)肝組織PCNA的表達(dá)與術(shù)前相比明顯升高，有明顯差異(P<0.01)；免疫組化示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，術(shù)后6h小鼠殘肝組織PCNA的表達(dá)均較對(duì)照組低，兩組比較有明顯差異(P<0.05)；術(shù)后12h、24h、36h、48h小鼠殘肝組織PCNA的表達(dá)均較對(duì)照組低，兩組比較有明顯差異(P<0.01)。caspase-3免疫組化可見術(shù)后6小時(shí)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均有陽性表達(dá)，兩組比較有明顯差異(P<0.05)，其余各時(shí)間點(diǎn)未見明顯陽性表達(dá)。

12、r>　　 結(jié)論：
　　 1、在肝部分切除后，數(shù)小時(shí)內(nèi)即出現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶升高，24h內(nèi)達(dá)到高峰，在該階段要重視肝功能的支持措施。
　　 2、小鼠肝部分切除術(shù)造成的急性肝損傷可誘導(dǎo)殘肝細(xì)胞通過細(xì)胞有絲分裂及細(xì)胞體積增大實(shí)現(xiàn)肝再生，并逐步使肝功能恢復(fù)。
　　 3、在小鼠肝部分切除術(shù)后急性肝損傷后6h內(nèi)殘肝即已經(jīng)啟動(dòng)再生，12小時(shí)后開始有絲分裂，約在術(shù)后36小時(shí)細(xì)胞有絲分裂達(dá)高峰，且48h內(nèi)肝再生逐漸增強(qiáng)。
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