Cdc6在小鼠肝切除后肝再生中作用的研究.pdf

1、目的：本試驗(yàn)分二個(gè)部分：1、設(shè)計(jì)并構(gòu)建小鼠Cdc6基因的RNAi真核表達(dá)載體pGCsi_U6/Neo/GFP/RNAi。通過(guò)尾靜脈快速注射法將真核表達(dá)載體pGCsi-U6/Neo/GFP/RNAi轉(zhuǎn)染至小鼠肝細(xì)胞中，運(yùn)用熒光顯微鏡及RR-PCR方法觀察干擾效果。2、通過(guò)觀察肝切除后小鼠肝細(xì)胞中Cdc6表達(dá)變化及其對(duì)肝細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響來(lái)探討其在肝切除后肝再生的作用。 方法： 根據(jù)GenBank中Cdc6的序列，設(shè)計(jì)

2、并構(gòu)建小鼠Cdc6基因的RNAi真核表達(dá)載體pGCsi_U6/Neo/GFP/RNAi。通過(guò)尾靜脈將質(zhì)粒快速注射入小鼠體內(nèi)，觀察其對(duì)肝細(xì)胞中Cdc6基因表達(dá)的影響。以此組小鼠為RNAi組，同時(shí)設(shè)立空載體組及空白對(duì)照組。采用Higgins＆Aderson創(chuàng)建的經(jīng)典小鼠肝部分切除術(shù)模型，即分別于肝左葉、中葉根部結(jié)扎切除。在術(shù)后0h、6h、12h、24h、72h五個(gè)不同的時(shí)相點(diǎn)，分離肝細(xì)胞。肝細(xì)胞分離方法采用肝臟原位勻速加離體循環(huán)膠原酶灌注法

3、，得到肝細(xì)胞沉淀。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色判斷測(cè)定細(xì)胞活性，細(xì)胞計(jì)數(shù)。①用流式細(xì)胞法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖周期的變化②裂解細(xì)胞提取蛋白及RNA，采用Westernblot和RT-PCR方法測(cè)定各組細(xì)胞的Cdc6蛋白及基因表達(dá)情況。⑧有3H-亮氨酸摻入法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖率。 結(jié)果： 1.經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，Cdc6基因的RNAi真核表達(dá)載體的模板序列與設(shè)計(jì)序列完全正確，成功構(gòu)建pGCsi_U6/Neo/GFP/RNAi干擾質(zhì)粒。 2.通

4、過(guò)尾靜脈注射法將質(zhì)粒pGCsi_U6/Neo/GFP/RNAi轉(zhuǎn)染到小鼠肝細(xì)胞中，經(jīng)熒光顯微鏡觀察到綠色熒光。 3.經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，平均每只鼠肝可獲取1.5×107個(gè)肝細(xì)胞。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞平均活性為96％。剛剛分離的肝細(xì)胞倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)肝細(xì)胞呈單個(gè)分散狀態(tài)，呈圓球形，細(xì)胞折光性強(qiáng)，接種4h后肝細(xì)胞貼壁、伸展，連接成條索狀；24h后絕大多數(shù)肝細(xì)胞貼壁，呈扁平狀、體積明顯增大，連接成島嶼狀；48h后肝細(xì)胞貼壁牢固，伸展

5、為上皮樣，連接成片。分離培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)完全符合典型的肝細(xì)胞形態(tài)特征。 4.在空載體組及空白對(duì)照組中，肝細(xì)胞中Cdc6的含量由6h開(kāi)始升高，在24h達(dá)到高峰(P＜0.01)，72h有所降低；RNAi組Cdc6蛋白的含量在各時(shí)相點(diǎn)均表現(xiàn)為低水平表達(dá)，在各時(shí)相點(diǎn)之間變化趨勢(shì)也不明顯。 5.在術(shù)后12h、24h、48h和72h時(shí)相點(diǎn)，空載體組及空白對(duì)照組肝細(xì)胞3H-亮氨酸摻入率分別與RNAi組相比較在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有非常顯著差異(P＜

6、0.01)。從組內(nèi)比較看，空白對(duì)照組隨時(shí)間的變化細(xì)胞3H-亮氨酸摻入率在持續(xù)增加，從術(shù)后6h即有變化，24h更為明顯，但是24h到72h之間變化較慢，維持在較高水平；空載體組和空白對(duì)照組具有相似性變化；而實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3H-亮氨酸摻入率0h-72h一直保持在較低水平，變化不大。 6.與RNAi組相比，空載體組與空白對(duì)照組G0/G1期細(xì)胞逐漸降低，S期細(xì)胞明顯增加，在術(shù)后各個(gè)時(shí)相點(diǎn)與RNAi組有明顯差異(P＜0.05或者P＜0.01)

7、，其高峰在術(shù)后24h，72h有明顯降低。另外，空載體組和空白對(duì)照組相比較，差異無(wú)顯著性。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建pGCsi_U6/Neo/GFP/RNAi干擾質(zhì)粒，并通過(guò)尾靜脈注射法成功將質(zhì)粒pGCsi_U6/Neo/GFP/RNAi轉(zhuǎn)染到小鼠肝細(xì)胞中。 2.小鼠肝部分切除術(shù)后早期Cdc6表達(dá)增加，由6h開(kāi)始升高，在24h達(dá)到高峰，72h有所降低，提示Cdc6基因在肝切除術(shù)后早期即被激活。 3.小鼠肝部分切

8、除術(shù)后早期即被激活的Cdc6基因可以明顯促進(jìn)肝細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)。隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，肝細(xì)胞3H-亮氨酸摻入率在持續(xù)增加，從術(shù)后6h升高，24h達(dá)到高峰，72h開(kāi)始降低；而轉(zhuǎn)染后的小鼠肝細(xì)胞3H-亮氨酸摻入率則變化不大。 4.小鼠肝部分切除術(shù)后肝細(xì)胞明顯處于增殖狀態(tài)，G0/G1期細(xì)胞逐漸降低，S期細(xì)胞明顯增加。而轉(zhuǎn)染后小鼠肝細(xì)胞則停滯于G0/G1期，說(shuō)明這種增殖狀態(tài)和Cdc6基因在肝部分切除術(shù)后早期激活密切相關(guān)。也說(shuō)明C