AMPA受體在癲癇后認(rèn)知功能損傷大鼠海馬中的表達(dá)變化.pdf

1、目的：癲癇(epilepsy，EP)是一組不同病因引起的慢性腦部疾病，以大腦神經(jīng)元過(guò)度放電所致的短暫中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征，具有反復(fù)發(fā)作的傾向。癲癇的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚未完全闡明。很多癲癇患者除臨床癇性癥狀發(fā)作外，常伴有學(xué)習(xí)記憶減退，成為影響患者生存質(zhì)量的一個(gè)重要原因。有學(xué)者研究認(rèn)為癲癇患者30％～40％存在認(rèn)知功能障礙。a-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸(a-amino-3-hydroxy-5-met-hyl-4-isoxa

2、zolepropionic acid，AMPA)受體是谷氨酸受體的一個(gè)亞型，AMPA受體是由GluR1～GluR4(或GluRA-GluRD)組成的異源型4聚體復(fù)合物，其中GluR1是AMPA受體的一個(gè)重要組成部分。近年來(lái)研究認(rèn)為，GluR1與正常突觸傳遞，突觸可塑性以及空間學(xué)習(xí)記憶均密切相關(guān)。迄今為止，GluR1與癲癇后認(rèn)知功能障礙關(guān)系的研究甚少。本試驗(yàn)利用戊四氮(pentylenetrazole，PTZ)誘導(dǎo)出慢性癲癇動(dòng)物模型(ch

3、ronicepileptic group，CEP)，通過(guò)腦電圖(electroencephalogram，EEG)， Morris水迷宮試驗(yàn)(Morris water mazet)、交替電刺激Y迷宮試驗(yàn)(alternative electro-stimulus Y maze test，AESYT)、逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)、免疫組織化

4、學(xué)染色技術(shù)，觀察GluRl在癲癇大鼠海馬的表達(dá)變化，以探討其與癲癇后大鼠認(rèn)知功能改變的關(guān)系，為進(jìn)一步研究癲癇患者記憶損害的機(jī)制提供線索。 方法： 1、造模 1.1 分組成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，體重(200±20)g，經(jīng)過(guò)兩次交替電刺激Y迷宮試驗(yàn)篩選，合格者進(jìn)行模型制備。篩選后獲得合格動(dòng)物48只，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成兩組：慢性癲癇發(fā)作組(CEP組)和對(duì)照組(NG組)。制模過(guò)程中大鼠出現(xiàn)

5、死亡或不符合模型要求者，予以剔除并隨機(jī)補(bǔ)充，以保證每組動(dòng)物8只。 1.2 慢性癲癇動(dòng)物模型的建立慢性癲癇發(fā)作組(CEP組)每日腹腔注射1％PTZ35mg/kg，直到大鼠連續(xù)3次注射期間均有RacineⅣ級(jí)或以上的癇性發(fā)作被認(rèn)為完全點(diǎn)燃。對(duì)照組(NG組)同時(shí)腹腔注射同等容量的生理鹽水。 2、腦電圖 CEP組大鼠完全點(diǎn)燃后，每組隨機(jī)取2～3只大鼠，麻醉后固定于腦立體定位儀上，放置雙側(cè)皮質(zhì)和雙側(cè)海馬電極，待大鼠清醒后，

6、腹腔注射PTZ致大鼠有癇性發(fā)作，并描記腦電圖，驗(yàn)證點(diǎn)燃效果。 3、認(rèn)知功能檢測(cè)造模成功后第31天，分組進(jìn)行認(rèn)知功能檢測(cè)。分別進(jìn)行交替電刺激Y迷宮試驗(yàn)和Morris水迷宮試驗(yàn)。 4、逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)認(rèn)知功能檢測(cè)完畢后迅速分離海馬。經(jīng)提取海馬總RNA、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA、引物擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，用UVP凝膠圖像成像系統(tǒng)掃描定量并攝像電泳條帶的灰度。凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。 5、免疫組織化學(xué)染色麻醉狀態(tài)下經(jīng)

7、左心室行主動(dòng)脈插管，4％多聚甲醛溶液進(jìn)行灌注，取腦固定，常規(guī)包埋，標(biāo)本冠狀位石蠟切片。經(jīng)抗原修復(fù)、羊血清封閉后，分別加GluR1多克隆抗體，再經(jīng)二抗、三抗孵育，DAB顯色后置顯微鏡下觀察記錄。 結(jié)果： 1、癲癇行為學(xué)各模型組大鼠均出現(xiàn)不同程度的癇性發(fā)作，造模成功。 2、腦電圖改變CEP組大鼠陣發(fā)出現(xiàn)大量高幅尖波、棘波、棘慢復(fù)合波。 NG組大鼠腦電圖以a、β波，散在θ波即基礎(chǔ)波為主，無(wú)明顯節(jié)律。 3

8、、認(rèn)知功能檢測(cè)3.1 Morris水迷宮試驗(yàn)3.1.1 定位航行試驗(yàn)(Place navigation test，PNT)CEP組與NG組相比，第1天無(wú)明顯差異(P>0.05)，第2天高于NG組，差異有顯著性(P<0.05)，第3天差異更為顯著(P<0.01)。 3.1.2 空間探索試驗(yàn)(spatial probe test，SPT)CEP組大鼠120秒內(nèi)穿越平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)明顯低于NG組，差異有顯著性(P<0.01)，在平臺(tái)象限

9、的游泳時(shí)間兩組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 3.2交替電刺激Y迷宮試驗(yàn)CEP組與NG組比較大鼠的錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)增多(P<0.05)，但全天總反應(yīng)時(shí)間，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 4、逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)CEP組大鼠海馬GluR1mRNA表達(dá)水平低于相應(yīng)對(duì)照組，差異有顯著性(P<0.05)。 5、免疫組織化學(xué)染色GluR1的免疫陽(yáng)性產(chǎn)物在對(duì)照組及CEP組海馬各區(qū)有弱陽(yáng)性表達(dá)，兩組相比，CEP組海馬CA1、CA