癲癇引起認知功能障礙與海馬NR2B表達的變化.pdf

1、目的：癲癇是由多種原因引起的慢性腦功能障礙綜合癥，是神經(jīng)系統(tǒng)常見病。癲癇患者除癲癇發(fā)作外，常伴有注意力分散、學(xué)習(xí)記憶能力減退等認知功能受損的表現(xiàn)。其中學(xué)習(xí)記憶能力減退是癲癇患者認知障礙中最常見的癥狀，越來越引起人們的重視。但是由于其機制還不清楚，所以在臨床工作中還找不到行之有效的方法來防治癲癇引起的認知障礙。我們利用戊四氮(pentylenetetrazole,PTZ)慢性癲癇動物模型，觀察慢性點燃癲癇大鼠腦電圖和學(xué)習(xí)記憶能力的改變，并

2、運用免疫組織化學(xué)和反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)方法觀察其海馬N-甲基-D-天門冬氨酸受體(N-methyl-D-asparateReceptors,NMDA)受體的2型受體(NR2)B亞單位(NMDAreceptor 2B,NR2B)，的表達變化，對癲癇引起的認知功能障礙的機理進行探討，為臨床實踐提供理論基礎(chǔ)。 方法： 1.造模 采用戊四氮腹腔注射慢性點燃癲癇(chronic epilepsy，CEP)模型，選取經(jīng)Y迷宮篩

3、選合格的清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠100只，實驗起始質(zhì)量200±20 g，12h光亮/黑暗條件、22～25℃環(huán)境溫度，分籠喂養(yǎng)。隨機分為兩組：慢性癲癇組(chronic epilepsy goup，CEP組)60只，正常對照組(normal control goup，NC組)40只。CEP組大鼠每日晨8:00～9:00腹腔注射PTZ 35 mg/kg，連續(xù)30天，每天注射完畢后觀察1小時。NC組大鼠給予同等劑量、

4、同等次數(shù)的生理鹽水。依據(jù)Racine分級標(biāo)準(zhǔn)將大鼠行為分為6級。0級：無任何反應(yīng)；Ⅰ級：胡須動、面肌抽動；Ⅱ級：點頭、咀嚼或濕狗樣抖動(wet dog shakes,WDS)；Ⅲ級：一側(cè)前肢抬起、陣攣；Ⅳ級：站立伴有雙側(cè)前肢陣攣；V級：跌倒、全身強直陣攣性發(fā)作。完全點燃的標(biāo)準(zhǔn)是獲得連續(xù)3次Ⅳ級或以上的運動驚厥。 2 腦電圖將大鼠麻醉后固定于腦立體定位儀上，將電極放置于雙側(cè)皮質(zhì)和雙側(cè)海馬部位，按上述模型分組描記腦電圖。 3.行為學(xué)

5、檢測應(yīng)用Y迷宮、水迷宮、檢測大鼠癲癇前后學(xué)習(xí)記憶及情感反應(yīng)能力的變化。 4 免疫組織化學(xué)染色行為學(xué)檢查后，分別隨機選取模型組和對照組大鼠各8只在水合氯醛深度麻醉下灌注，取腦固定，常規(guī)包埋，標(biāo)本冠狀位石蠟切片。經(jīng)抗原修復(fù)、羊血清封閉后，加多克隆抗體，再經(jīng)二抗、三抗孵育，DAB顯色后置顯微鏡下觀察記錄。 5 逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)行為學(xué)檢查后，分別隨機選取模型組和對照組大鼠各8只，迅速分離海馬，經(jīng)提取海馬總RNA、逆轉(zhuǎn)錄合成cD

6、NA、引物擴增后，擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像系統(tǒng)掃描定量并攝像電泳條帶的灰度，凝膠圖象分析系統(tǒng)分析結(jié)果。 結(jié)果： 1.動物模型制備CEP組大鼠在連續(xù)注射第6～10天起開始出現(xiàn)凝視、點頭、反復(fù)洗臉動作、面部及頭部抽搐等，以后發(fā)作癥狀逐日加重，于給藥第18～24天全部出現(xiàn)全身肌陣攣、雙前肢抬起，最終發(fā)生全身強直.陣攣性發(fā)作，伴有跌倒、翻滾及流涎，達到RacineⅣ～V級的點燃標(biāo)準(zhǔn)，繼續(xù)給藥至30天。NC組動物均無

7、癲癇發(fā)作表現(xiàn)。 2.腦電圖結(jié)果NC組表現(xiàn)為基本波動為9-11Hzα節(jié)律，低、中輻兩側(cè)對稱CEP組大鼠發(fā)作間期的腦電圖表現(xiàn)為基本波動為低幅的9-11Hzα節(jié)律，陣發(fā)性出現(xiàn)癇性放電，表現(xiàn)為高幅多棘綜合波，持續(xù)1-2秒。 3.行為學(xué)檢測3.1水迷宮試驗癲癇后，CEP組大鼠逃避潛伏期第1天與對照組比較，無顯著性差異(P＞0.05)，第2天高于對照組(P＜0.05)，第3天差異更為顯著(P＜0.01)。120秒內(nèi)為搜尋平臺而穿越平

8、臺區(qū)域的次數(shù)明顯低于NG組(P＜0.01)，在平臺所在象限的游泳時間與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)。 3.2 Y迷宮試驗CEP組與對照組比較大鼠的錯誤反應(yīng)次數(shù)增多(P＜0.05)，但全天總反應(yīng)時間，兩組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 4 免疫組化結(jié)果CEP組海馬CA3區(qū)NR2B陽性神經(jīng)元的數(shù)目較對照組顯著減少(P＜0.01)。 5 逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)CEP組NR2B mRNA表達水平低于相應(yīng)