癲癇大鼠認知功能障礙與海馬AchE陽性纖維分布及其超微結構改變的關系.pdf

1、目的：癲癇是由多種原因引起的慢性腦功能障礙綜合癥，是神經(jīng)系統(tǒng)常見病。癲癇引起的認知障礙已經(jīng)越來越受到了人們的重視，但是由于其機制還不清楚，所以在臨床工作中還找不到行之有效的方法來防治癲癇引起的認知障礙。我們利用急慢性癲癇動物模型，通過觀察動物行為學、腦電圖、海馬各區(qū)膽堿能神經(jīng)纖維密度的變化以及海馬超微結構的改變，對癲癇引起認知功能障礙的機理進行探討，為臨床實踐提供理論基礎。 方法1造模1.1應用Y迷宮篩選認知功能正常的大鼠。

2、 1.2癲癇持續(xù)狀態(tài)模型 經(jīng)過認知功能檢測合格的健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(重200±20g)50只，隨機分為2組，癲癇持續(xù)狀態(tài)模型組(statusepilepticusgroup,SE)30只，正常對照組(ControlⅠ)20只。應用致癇劑戊四氮(Pentetrazole，PTZ)40mg/kg對SE組大鼠腹腔注射，10min后注射20mg/kg，然后每10min注射10mg/kg，直至癲癇發(fā)作達到Ra

3、cine分級標準Ⅳ～Ⅴ級，持續(xù)30min以上。ControlⅠ組大鼠腹腔注射同等容量相同次數(shù)的生理鹽水。 1.3慢性癲癇模型 經(jīng)過認知功能檢測合格的健康SD大鼠(重200±20g)50只，隨機分為2組，慢性癲癇模型組(ChronicepilepticusgroupCEP)30只，正常對照組(ControlⅡ)20只。CEP組按35mg/kg經(jīng)腹腔注射PTZ溶液，隔日操作，直至自發(fā)出現(xiàn)癇性發(fā)作(Racine分級標準Ⅳ～Ⅴ級

4、)3次以上。ControlⅡ組大鼠腹腔注射同等容量相同次數(shù)的生理鹽水。 2腦電圖將正常大鼠麻醉后固定于腦立體定位儀上，將電極放置于雙側皮質(zhì)和雙側海馬部位，按上述模型分組描記腦電圖(electroencephalogram，EEG)。 3行為學檢測應用Y迷宮、水迷宮、抬高迷宮、曠場試驗、斜板試驗和懸吊試驗檢測大鼠癲癇前后學習記憶及情感反應能力的變化。 4膽堿酯酶陽性纖維的檢測模型制備成功后10天和30天分別隨機選取

5、兩模型組和對照組大鼠各10只在水合氯醛深度麻醉下灌注，取中段海馬，4％多聚甲醛浸泡固定6h，然后組織塊放入20-30％蔗糖沉底，恒冷箱切片機切片(20um)。按Hedreen等推薦的方法顯示膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE)陽性纖維。 5電鏡標本制作及觀察模型制備成功后1天和30天分別隨機選取兩種模型及對照組大鼠各6只在深度麻醉下用冷生理鹽水、固定液經(jīng)左心室主動脈灌注，取中段海馬組織，解剖鏡定位，選擇

6、海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)用組織固定液固定，包埋，鉛染色，透射電鏡觀察。 結果1篩選認知功能正常的大鼠110只大鼠中100只認知篩查合格。2模型大鼠癲癇發(fā)作情況：SE、CEP模型大鼠均出現(xiàn)不同程度的癇性發(fā)作，造模成功。 3腦電圖結果正常對照組表現(xiàn)為基本波動為9-11Hzα節(jié)律，低、中輻兩側對稱。 SE組大鼠第一次注射PTZ后20min左右，出現(xiàn)癇性發(fā)作，EEG顯示癇性電波的發(fā)放，包括棘波、尖波、棘-慢波及尖-慢波，注

7、射后5h內(nèi)放電較頻繁，發(fā)作間期EEG顯示為α波、β波及散在θ波。 CEP組大鼠發(fā)作間期的腦電圖表現(xiàn)為在基本波動為低幅的9-11Hzα節(jié)律，陣發(fā)性出現(xiàn)癇性放電，表現(xiàn)為高幅多棘綜合波，持續(xù)1-2秒。 4行為學檢測 4.1水迷宮試驗 SE組大鼠和CEP組大鼠在致癇后1天、10天，搜尋站臺時在站臺所在象限的游泳時間百分比降低；穿過站臺區(qū)域的次數(shù)減少，與對照相比差異有顯著性。兩組大鼠致癇30天后搜尋站臺時在站臺所在

8、象限的游泳時間百分比，穿過站臺區(qū)域的次數(shù)與對照相比無明顯差別(P＞0.05)。 4.2Y迷宮試驗 SE組與對照組相比在致癇后的第1天、10天和30天的訓練階段的錯誤次數(shù)均無明顯差別(P＞0.05)，但在致癇后的第2天、11天和31天的記憶保持階段的錯誤次數(shù)卻均有明顯的差別(P＜0.05)。CEP組與對照組相比在致癇后的第1、2、10、30天，錯誤次數(shù)無明顯差異。而在第11和31天的記憶保持階段其錯誤次數(shù)卻有明顯差異(P＜

9、0.05)。 4.3曠場試驗 SE組大鼠于致癇后1天曠場活動的格子數(shù)、站立次數(shù)及排出糞便的顆粒數(shù)均顯著少于對照組(P＜0.05)；CEP組大鼠于致癇后1天曠場活動的格子數(shù)少于對照組(P＜0.05)，而站立次數(shù)及排便顆粒數(shù)與對照組相比無明顯減少(P＞0.05)。兩組大鼠致癇后10天和30天的活動水平、站立次數(shù)及糞便顆粒數(shù)均與對照組無明顯的差別(P＞0.05)。 4.4抬高迷宮試驗 SE組大鼠于致癇后1天在抬

10、高迷宮開放臂中逃避時間明顯延長，進入開放臂的次數(shù)增多，差異有顯著性(P＜0.05)。而SE組大鼠致癇后10天和30天及CEP組大鼠致癇成功后的1天、10天和30天在抬高迷宮開放臂中逃避時間和進入次數(shù)與對照組相比均無明顯差異(P＞0.05)。 4.5斜板試驗和懸吊試驗 各試驗組大鼠的轉(zhuǎn)體能力和懸吊能力與對照組相比在致癇后的1天、10天和30天三個不同時間點均無明顯差異(P＞0.05)。 5組化結果 正常大鼠

11、海馬分子層可見大量AChE陽性神經(jīng)纖維。無論SE還是CEP模型，致癇后10天海馬CA1、CA2、CA3、齒狀回分子層AChE陽性神經(jīng)纖維的密度比對照組顯著減少(P＜0.05)，致癇后30天二者與對照組無明顯差異。 6電鏡觀察 發(fā)現(xiàn)致癇后1天SE組大鼠海馬CA3和齒狀回神經(jīng)元胞體固縮濃染，線粒體嵴局部消失，突起膜發(fā)生斷裂，髓鞘板層松散，突觸前后膜模糊，突觸小泡減少，線粒體空化，星形膠質(zhì)細胞高度水腫液化核固縮，CEP組還出現(xiàn)

12、了突觸小泡增多。致癇后30天兩組動物以上變化逐漸消失。 結論 1.成功建立了PTZ誘發(fā)的SE、CEP大鼠模型。 2.水迷宮、Y迷宮可以檢測大鼠的認知能力，抬高迷宮可以檢測大鼠的情感反應能力，曠場試驗可以檢測大鼠的活動水平，斜板、懸吊試驗可以檢測大鼠的運動能力。 3.癲癇引起的認知功能障礙及情感反應異?？赡芘c海馬膽堿能神經(jīng)纖維的減少有關。 4.癲癇引起的認知功能障礙及情感反應異?？赡芘c海馬神經(jīng)元的突