mGluR1在自發(fā)性癲癇大鼠海馬中異常表達(dá).pdf

1、前言: mGluR1是代謝型谷氨酸受體中的一員，屬于G蛋白偶聯(lián)受體，具有七個(gè)跨膜基序，受體的細(xì)胞外區(qū)(N端)、跨膜區(qū)及其細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的肽鏈環(huán)具有高度保守性。目前認(rèn)為，mGluR1主要與磷脂酶C(PLC)和細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)偶聯(lián)，通過(guò)調(diào)節(jié)多種跨膜離子通道和細(xì)胞內(nèi)第二信使系統(tǒng)的活性進(jìn)而調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性及突觸傳遞。 自發(fā)性癲癇大鼠(SERs)是該校2000年從日本京都大學(xué)引進(jìn)的遺傳性癲癇動(dòng)物模型，它是一種純合型的雙基因突變大鼠，

2、其突變基因血來(lái)自于東京Wistar大鼠突變系tremor，突變基因zi來(lái)自于德國(guó)斯普拉格-道利鼠突變系z(mì)itter，兩種突變基因均為常染色體隱性遺傳。出生后8周，SERs就會(huì)自發(fā)性的出現(xiàn)癲癇大發(fā)作和失神樣小發(fā)作，以及低電壓快波和5～7Hz棘波與慢波混合的腦電圖。SERs對(duì)抗癲癇藥的反應(yīng)同癲癇患者相似：小發(fā)作可以被三甲雙酮和乙琥胺阻滯，癲癇持續(xù)狀態(tài)可被苯妥英阻滯，而它們又都可以為苯巴比妥、丙戊酸鈉阻滯。因此，SERs是學(xué)習(xí)人類(lèi)遺傳性癲癇、

3、評(píng)價(jià)抗癲癇藥的極好動(dòng)物模型。 癲癇病因復(fù)雜，目前認(rèn)為興奮性和抑制性氨基酸失衡，在癲癇發(fā)病中起十分重要的作用。本文欲通過(guò)幾種實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)在SERs海馬中mGluR1表達(dá)的情況，尋找興奮性和抑制性氨基酸失衡在癲癇發(fā)病中的作用，進(jìn)一步揭示癲癇可能的發(fā)病機(jī)制。 材料與方法: 1、RT-PCR技術(shù)檢測(cè)mGluR1 mRNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Wistar大鼠和SERs 2～3個(gè)月齡，在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)(12h交替照明，濕度為50％

4、～70％，24℃)，動(dòng)物自由進(jìn)食飲水，每組8只。 標(biāo)本制備：大鼠在麻醉狀態(tài)下斷頭，迅速取出腦，剝離海馬置-80℃凍存?zhèn)溆?。Trizol法提取總RNA，測(cè)量總純度，若OD260/OD280在1.8～2.0之間，表示樣品RNA較純，符合實(shí)驗(yàn)要求。RT-PCR反應(yīng)：mGluR1引物，452bp(上游：5'-CATGCCCATT-TTGTCCTACC-3’，下游：5’-CTTCTTTCTCCGGAAAATGTTG-3’)；mGluR5，

5、448bp(上游：5’-GCTCATGGAGCAGATCAGC-3’，下游：5’-TGAAGAAC TCTGCGTGT-AATC-3’)；β-actin為內(nèi)參引物，300bp(上游5’-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3’，下游： 5’-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3’)。取1μg總RNA，參照Takara公司RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，RT反應(yīng)條件：42℃ 30min、99℃ 5min、5℃ 5min。反應(yīng)體

6、積為25μl，PCR反應(yīng)條件：首先94℃ 4min，之后94℃ 1min，52℃ 1min、72℃ 90sec共擴(kuò)增33個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。1.5％瓊脂糖凝膠電泳后，電泳結(jié)果經(jīng)Fluor ChemTM Imaging System圖像分析儀測(cè)定平均累積光密度值。 2、免疫組織化學(xué)染色(SP法)檢測(cè)mGluR1蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Wistar大鼠和SERs均為2～3個(gè)月齡，在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)(12h交替照明，濕度為50％

7、～70％，24℃)，動(dòng)物可自由進(jìn)食飲水，每組5只。 步驟：大鼠腦組織的灌流固定，石蠟包埋，石蠟切片，抗原修復(fù)，一抗孵育，二抗孵育，DAB顯色，圖像采集與分析。 3、Western blotting法檢測(cè)mGluR1蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Wistar大鼠和SERs均為2-3個(gè)月齡，在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)(12h交替照明，濕度為50％～70％，24℃)，動(dòng)物可自由進(jìn)食飲水，每組5只。 步驟：膜蛋白提取，蛋白定量，SDS-PAG

8、E凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)印，一抗孵育，二抗孵育，DAB顯色，灰度掃描及分析。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Student-t檢驗(yàn)，p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、半定量RT-PCR檢測(cè)mGluR1 mRNA表達(dá)結(jié)果顯示SERs海馬中mGluR1的mRNA(0.76±0.15)表達(dá)低于Wistar大鼠(1.02±0.26)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2、免疫組化SP法檢測(cè)SERs和Wistar鼠mGluR1蛋

9、白表達(dá)mGluR1蛋白在兩種鼠的海馬各區(qū)均有分布，SERs海馬各區(qū)單個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞上mGluR1蛋白密度較Wistar鼠的增強(qiáng)。SER海馬DG區(qū)mGluR1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著低于Wistar鼠，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CA3區(qū)mGluR1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)低于Wistar鼠，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CA1區(qū)mGluR1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)略低于Wistar鼠,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3、Western blotting法檢測(cè)mGluR1蛋白表達(dá)與免疫組化的結(jié)果一致，SERs海馬中m