ANO1在自發(fā)性高血壓大鼠血管中的表達及作用研究.pdf

1、原發(fā)性高血壓（EH）是一種獨立的疾病，同時又是導致動脈粥樣硬化、腦卒中等心腦血管疾病的高危因素，因此，如何有效的防治 EH的發(fā)生發(fā)展對于預防心腦血管疾病至關重要。然而，到目前為止，由于 EH的發(fā)病機制還不清楚，限制了臨床上對 EH疾病的防治。經(jīng)典的鈣激活氯通道（CaCC）廣泛存在于心血管系統(tǒng)中，參與調節(jié)心肌細胞興奮性及血管平滑肌的舒縮功能。然而由于其編碼基因未知，限制了經(jīng)典CaCC在心血管系統(tǒng)中作用的進一步研究，直到Anoctamin1

2、（ANO1）——anoctamins家族中的一員，被證實為經(jīng)典的CaCC的編碼基因，才開啟了經(jīng)典CaCC在心血管系統(tǒng)中的作用研究的新篇章。最新資料表明，ANO1編碼的CaCC參與了對機體動脈血壓的調節(jié)；然而，ANO1是否參與了EH的發(fā)病過程呢？目前未見報道。因此，我們以自發(fā)性高血壓大鼠（SHRs）為EH的動物模型，針對ANO1在EH發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮的作用進行如下探討：（1）鑒定ANO1在SHRs不同部位血管中的功能性表達的情況；（

3、2）觀察ANO1對SHRs血壓的影響及可能的機制。
　　研究內容及所用的實驗方法：
　　1．利用Western blotting方法觀察ANO1在SHRs不同部位血管組織中的表達；急性分離血管平滑肌細胞（VSMCs），利用全細胞膜片鉗技術，記錄VSMCs ANO1依賴性的鈣激活氯電流。
　　2.利用Western blotting方法檢測ANO1是否存在糖基化修飾。
　　3．組織貼塊法原代培養(yǎng)大鼠VSMCs，觀察

4、ANO1的表達及功能。
　　4.利用血管灌流方法，針對大鼠腸系膜動脈環(huán)進行研究，利用ANO1的特異性抑制劑T16Ainh-A01探討ANO1對血管舒縮功能的影響。
　　5．利用siRNA-ANO1干擾技術減弱SHRs內源性ANO1的功能性表達，進一步觀察ANO1對SHRs收縮壓（SBP）及舒張壓（DBP）的影響。
　　6．利用MTT法，觀察ANO1在血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導的VSMCs增殖中的作用；并利用原代培養(yǎng)的

5、VSMCs，借助基因干擾技術進一步驗證ANO1對VSMCs胞內鈣信號的影響。
　　實驗結果：
　　1.與Wistar-Kyoto（WKY）大鼠相比，在SHRs頸動脈、胸主動脈、腸系膜動脈及其分支、股動脈及其分支組織中，ANO1的蛋白（150kD±)表達均顯著增多（P<0.01）；在原代培養(yǎng)的WKY大鼠及SHRs主動脈及腸系膜動脈SMCs上ANO1的蛋白表達水平亦表現(xiàn)出相似的結果；
　　2.與來源于WKY大鼠主動脈及腸系

6、膜動脈的SMCs相比，在來源于SHRs胸主動脈及腸系膜動脈的SMCs，可記錄到更加強的鈣激活氯電流，表明在血管組織中表達的ANO1均為功能性CaCC。利用siRNA-ANO1減弱原代培養(yǎng)的SHRs腸系膜動脈的SMCs，所記錄到的鈣激活氯電流同未干擾的SMCs相比顯著減弱；該結果表明，在VSMCs上所記錄的鈣激活氯電流是由ANO1介導的。
　　3.給予糖苷酶F處理從SHRs及WKY大鼠胸主動脈中提取的蛋白后，檢測發(fā)現(xiàn)ANO1的蛋白分

7、子量由處理前150kD±下降至130kD±的水平，表明在大鼠血管組織中的ANO1蛋白存在著糖基化修飾。
　　4.分別給予1，2，5，10，20，30μmol/L的ANO1特異性抑制劑T16Ainh-A01預孵育SHRs及WKY大鼠腸系膜動脈環(huán)10min，然后給予1μmol/L的苯腎上腺素（PE）收縮血管。結果顯示，10μmol/L T16Ainh-A01能夠顯著抑制PE誘導的WKY大鼠腸系膜動脈環(huán)的收縮，并且能夠引起1μmol/L

8、 PE預收縮的血管舒張；而20μmol/L T16Ainh-A01則能夠明顯抑制PE誘導的SHRs腸系膜動脈環(huán)的收縮效應，表明可能是由于SHRs腸系膜動脈ANO1蛋白表達高于WKY，故需更大濃度的抑制劑才能表現(xiàn)出明顯的抑制效應。在原代培養(yǎng)的WKY腸系膜動脈SMCs，10μmol/L T16Ainh-A01能夠減弱PE誘導的胞內鈣熒光信號強度，說明抑制ANO1活性，可以通過降低VSMCs胞內鈣來引起血管舒張。
　　5.選取12周齡的

9、SHRs和WKY大鼠，尾靜脈注射 ANO1特異性抑制劑T16Ainh-A01，檢測40min內大鼠SBP及DBP的變化。結果顯示，10μmol/L T16Ainh-A01能顯著降低WKY大鼠的SBP和DBP；而20μmol/LT16Ainh-A01則能夠明顯降低SHRs SBP和DBP；鼠尾靜脈注射siRNA-ANO1-Lipofectamin混合物，減弱SHRs內源性ANO1的功能性表達，觀察注射后5d以內SHRs血壓的變化情況。結果

10、顯示，減弱內源性ANO1的功能性表達，能夠顯著抑制SHRs動脈血壓（SBP和DBP）（P<0.01）的升高。上述結果表明減弱內源性ANO1的功能性表達能夠降低SHRs的SBP和DBP，延緩SHRs高血壓的進展。由此說明，ANO1可能參與了SHRs高血壓的病理過程。
　　6.在原代培養(yǎng)的WKY大鼠腸系膜動脈SMCs，AngⅡ能夠以濃度依賴性方式和時間依賴性的方式顯著促進ANO1的表達（P<0.01）；給予1型AngⅡ受體（AT1R）

11、特異性抑制劑替米沙坦能夠顯著抑制AngⅡ誘導的ANO1的表達，而AT2R的特異性抑制劑PD123319則未表現(xiàn)出明顯的抑制效應；表明AngⅡ可能是通過AT1R介導促進VSMCs ANO1的表達。PI3K/Akt是AT1R的下游信號分子。結果顯示，SHRs腸系膜動脈中Akt的磷酸化水平較 WKY大鼠顯著升高；在原代培養(yǎng)的WKY腸系膜動脈SMCs，AngⅡ能夠以時間依賴性的方式提高Akt的磷酸化水平；給予PI3K的特異性抑制劑LY29400

12、2能夠顯著抑制AngⅡ誘導的來源于WKY大鼠的VSMCs ANO1的表達。這一結果表明AngⅡ誘導來源于WKY的大鼠VSMCs ANO1的表達可能是通過AT1R-PI3K-Akt通路來實現(xiàn)的。
　　7.同WKY大鼠腸系膜動脈相比較，SHRs腸系膜動脈增殖細胞核抗原（PCNA）表達顯著增多，與原代培養(yǎng)的腸系膜動脈SMCs結果一致；MTT的結果顯示AngⅡ能夠促進WKY大鼠源性VSMCs增殖；給予ANO1特異性抑制劑T16Ainh-A

13、01能夠顯著抑制SHRs源性VSMCs及AngⅡ誘導的WKY大鼠源性VSMCs PCNA的表達；同時檢測發(fā)現(xiàn)，利用siRNA-ANO1減弱SHRs VSMCs ANO1的表達，能夠抑制AngⅡ誘導的細胞胞內鈣的熒光信號強度。
　　綜上所述，ANO1在SHRs血管中高表達，可能促使了高血壓的發(fā)生發(fā)展，這一作用的發(fā)揮可能通過兩個方面機制來實現(xiàn)：一是促使VSMCs胞內鈣的升高，加強SHRs血管收縮；另一方面，通過促進VSMCs增殖，促進