葛根素對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓的干預(yù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、心腦血管病是目前我國發(fā)病率、致殘率和死亡率最高的疾病，而高血壓是心腦血管病的主要危險(xiǎn)因素之一。高血壓病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，有多種學(xué)說，如腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)激活、交感神經(jīng)系統(tǒng)活性增強(qiáng)、腎性水鈉潴留、內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷等是高血壓病主要學(xué)說。血管內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞構(gòu)成血管壁的主要部分，在維持血管張力及維持血管正常生理功能中至關(guān)重要，故本研究主要以主動(dòng)脈為載

2、體，研究葛根素的降壓機(jī)制。近些年來，越來越多的證據(jù)表明氧化應(yīng)激及其相關(guān)的氧化損傷是影響血管張力，參與高血壓病發(fā)生發(fā)展的主要原因之一。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelialnitric oxide synthase，eNOS)主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞分泌，是合成一氧化氮(nitric oxide，NO)的特異酶，在維持血管舒縮功能、抗氧化損傷、保護(hù)內(nèi)皮功能、抗血小板黏附聚集等多種生理病理過程中發(fā)揮作用。因此，研究eNOS及相關(guān)基

3、因在降壓及血管保護(hù)中的作用，對(duì)于高血壓病的防治具有重要意義。
　　近幾十年來，高血壓病的發(fā)病機(jī)制及抗高血壓藥物研究取得了一定進(jìn)展，臨床常用降壓藥在降低血壓和防治靶器官損害等方面取得較好療效。但也存在一些不足，如副作用多、終身服藥、禁忌癥多、部分藥物聯(lián)合使用受限等使藥物的臨床應(yīng)用受到了一定限制，部分患者的血壓指標(biāo)不能令人滿意。中醫(yī)藥對(duì)高血壓病的研究取得了許多成果，得到了越來越多學(xué)者的關(guān)注，在調(diào)節(jié)機(jī)體整體平衡、控制血壓水平穩(wěn)定等方面發(fā)

4、揮著獨(dú)特的優(yōu)勢，其防治高血壓病作用的多效性、增效減副性、多靶點(diǎn)性、前瞻性、穩(wěn)定持久性均體現(xiàn)出了中醫(yī)藥特色。
　　葛根始載于我國最早的中藥學(xué)著作《神農(nóng)本草經(jīng)》中，距今已有近2000年歷史。現(xiàn)代中藥學(xué)在繼承前人經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將葛根歸為解表藥，認(rèn)為其有解肌退熱、透疹、生津止渴、升陽止瀉的作用。葛根素注射劑的上市及臨床應(yīng)用是一重大突破。藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)，葛根素注射液有降低心肌耗氧量、擴(kuò)張心腦血管、增強(qiáng)心肌收縮、改善微循環(huán)等功效，在冠心病、心肌缺

5、血再灌注損傷、缺血性腦卒中、高血壓病、老年性癡呆等心腦血管疾病的治療中均發(fā)揮有效作用。
　　本研究以自發(fā)性高血壓大鼠為模型，主要研究葛根素注射液的降壓機(jī)制。實(shí)驗(yàn)在第一部分借助qPCR陣列批量、精確的優(yōu)勢，初步篩選葛根素降壓有效靶點(diǎn)。結(jié)果提示葛根素降壓機(jī)制與增加eNOS活性、激活eNOS/cGMP通路密切相關(guān)。基于此，為進(jìn)一步研究影響eNOS活性的因素，在實(shí)驗(yàn)第二部分，首先借助網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，檢索并得到與eNOS相關(guān)的基因，之后借助qP

6、CR陣列技術(shù)，進(jìn)一步研究葛根素降壓及血管保護(hù)機(jī)制。
　　本研究分為兩部分:文獻(xiàn)綜述和實(shí)驗(yàn)研究。
　　1文獻(xiàn)綜述:該部分從葛根的古今研究進(jìn)展、葛根素防治高血壓病的臨床和基礎(chǔ)研究進(jìn)展、高血壓與氧化應(yīng)激三部分進(jìn)行綜述。
　　2實(shí)驗(yàn)研究:包括以下兩部分:
　　研究一葛根素對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓的干預(yù)作用及機(jī)制初探
　　目的:
　　探討葛根素對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓的干預(yù)作用及機(jī)制。
　　方法:
　　

7、60只自發(fā)性高血壓大鼠隨機(jī)分為模型組（生理鹽水，腹腔注射給藥）、氯沙坦鉀組（每天按32.5mg·Kg-1灌胃給藥）、常規(guī)劑量葛根素組（每天按40mg·kg-1腹腔注射）和高劑量葛根素組（每天按80mg·kg-1腹腔注射），以Wistar-Kyoto(WKY)大鼠做為正常對(duì)照組（生理鹽水，腹腔注射給藥），每組15只，連續(xù)給藥10周。每周對(duì)大鼠收縮壓、舒張壓及心率進(jìn)行檢測。超聲心動(dòng)圖檢測大鼠主動(dòng)脈內(nèi)徑及心功能，以HE染色、馬松染色觀察藥物對(duì)

8、大鼠主動(dòng)脈病理組織形態(tài)學(xué)影響，并檢測大鼠血漿腎素-血管緊張素Ⅱ-醛固酮水平，以qPCR陣列技術(shù)檢測主動(dòng)脈高血壓相關(guān)基因mRNA水平的變化，繼而借助String及KEGGPathway數(shù)據(jù)庫對(duì)差異基因進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。用酶聯(lián)免疫吸附法和免疫蛋白印跡技術(shù)驗(yàn)證目的基因在蛋白水平的變化。
　　結(jié)果:
　　模型組收縮壓、舒張壓較對(duì)照組明顯升高(P＜0.001);與模型組比較，高劑量葛根素組、氯沙坦鉀組收縮壓、舒張壓均顯著降低(P＜0.05

9、或P＜0.01);給藥9周后，模型組心率較對(duì)照組明顯增加(P＜0.05)，高劑量、常規(guī)劑量葛根素組心率與模型組比較明顯降低(P＜0.01)，氯沙坦鉀組心率未見明顯變化(P＞0.05)。模型組主動(dòng)脈內(nèi)徑較對(duì)照組明顯增寬(P＜0.001);氯沙坦鉀組主動(dòng)脈內(nèi)徑較模型組顯著變窄(P＜0.05)，葛根素組較模型組未見明顯差異（P＞0.05），但有減小趨勢。模型組EF值、FS值較對(duì)照組均明顯降低(P＜0.01);葛根素高劑量、常規(guī)劑量組EF、FS

10、值較模型組明顯升高(P＜0.001)，氯沙坦鉀組較模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。模型組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度較對(duì)照組明顯增加(P＜0.001);與模型組比較，氯沙坦鉀組、葛根素高劑量、葛根素常規(guī)劑量組內(nèi)中膜厚度均顯著降低（P＜0.001）。模型組血漿腎素、血管緊張素Ⅱ水平與對(duì)照組比較均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);常規(guī)劑量、高劑量葛根素組血管緊張素Ⅱ水平較模型組顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，且較氯沙坦鉀組降低更為明顯

11、(P＜0.01);氯沙坦鉀組血管緊張素Ⅱ水平較模型組升高(P＜0.05);與模型組比較，給藥組均能顯著降低大鼠血漿中腎素水平(P＜0.01);各組間醛固酮水平未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。對(duì)qPCR陣列篩選得到的18個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，eNOS與Cav1、Agtr1b關(guān)系密切;此外，Adrb1、Agtr1b、Gucy1a3、Gucy1b3、Kcnma1、Mylk、Mylk3、eNOS、Pde3a、Pde5a均參與cGM

12、P/PKG通路的活化;Agtr1b、Gucy1a3、Gucy1b3、Kcnma1、Mylk、Mylk3、Ptgir參與血管平滑肌收縮;Gucy1a3、Gucy1b3、Mylk、Mylk3、eNOS、Ptgir均與血小板活化有關(guān)。用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中cGMP、PGI2水平，發(fā)現(xiàn)模型組血清中cGMP、PGI2水平較對(duì)照組均明顯下降(P＜0.05);與模型組相比，氯沙坦鉀組、高劑量及常規(guī)劑量葛根素組cGMP、PGI2水平均明顯升高(P＜

13、0.01或P＜0.001)。免疫蛋白印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)，模型組p-eNOS水平較對(duì)照組明顯降低(P＜0.01);與模型組比較，高劑量葛根素組p-eNOS水平明顯升高(P＜0.05)，氯沙坦鉀組無明顯統(tǒng)計(jì)意義，但較模型組有升高趨勢(P＞0.05)。各組eNOS總蛋白表達(dá)量無明顯差異(P＞0.05)。模型組Agtr1蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)，氯沙坦鉀、高劑量葛根素干預(yù)后能明顯降低主動(dòng)脈Agtr1蛋白水平(P＜0.01)。各組間A

14、gtr2蛋白水平無明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　葛根素降低自發(fā)性高血壓大鼠血壓，其機(jī)制與增加eNOS活性密切相關(guān)。葛根素通過下調(diào)Cav1、Agtr1b表達(dá)量，影響eNOS活性，此外eNOS/cGMP通路參與葛根素對(duì)血壓的調(diào)節(jié)。
　　研究二基于eNOS相關(guān)基因，進(jìn)一步探討葛根素的降壓機(jī)制
　　目的:
　　基于eNOS在血壓調(diào)控中的作用，探討葛根素對(duì)主動(dòng)脈的保護(hù)作用及機(jī)制。
　　方法:

15、>　　自發(fā)性高血壓大鼠隨機(jī)分組后，分別給藥葛根素和氯沙坦鉀，連續(xù)給藥10周后，以生化法檢測大鼠血清中NO、MDA、O2-·水平及SOD含量，酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清中eNOS水平，以qPCR陣列技術(shù)檢測主動(dòng)脈eNOS互作基因的變化，繼而借助String及KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫對(duì)差異基因進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，并檢測目的基因蛋白水平變化。
　　結(jié)果:
　　給藥10周后，模型組血清NO水平較對(duì)照組顯著降低(P＜0.001)，高劑

16、量葛根素組、氯沙坦鉀組大鼠NO水平較模型組顯著升高(P＜0.01或P＜0.001)。與對(duì)照組比較，模型組MDA水平明顯升高(P＜0.001);與模型組比較，常規(guī)劑量、高劑量葛根素組和氯沙坦鉀組MDA水平明顯降低(P＜0.01或P＜0.001)。模型組O2-·水平較對(duì)照組顯著升高(P＜0.001)，給藥組各組間O2-·水平較模型組無明顯差異(P＞0.05)，但有降低趨勢。各組間SOD含量較模型組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。模型組血清

17、eNOS水平較對(duì)照組明顯降低(P＜0.001)，與模型組比較，氯沙坦鉀組、高劑量葛根素組及常規(guī)劑量葛根素組eNOS水平明顯增加(P＜0.001或P＜0.01)。對(duì)qPCR陣列篩選得到的12個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，eNOS與HSP90β1、Cav1關(guān)系密切。此外，葛根素還影響Decr1、Gpx2、Prdx5、Prdx3等氧化酶的表達(dá)，參與PI3K/Akt、雌激素通路和黏著斑的調(diào)節(jié)。免疫蛋白印跡結(jié)果提示，模型組Hsp90蛋白表達(dá)水平

18、較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，氯沙坦鉀組、葛根素組Hsp90蛋白水平較模型組顯著降低(P＜0.05或P＜0.001)。模型組與對(duì)照組比較，PI3K蛋白表達(dá)量無明顯變化，但有降低趨勢;氯沙坦鉀、高劑量葛根素組PI3K蛋白表達(dá)量較模型組明顯升高(P＜0.001或P＜0.01)。各組間Akt及p-Akt蛋白水平均無明顯變化(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　葛根素可明顯降低大鼠血清中MDA水平，升高NO、eNOS水平;eNOS