GABABR1和mGluR1在外傷性癲癇患者病灶中的表達.pdf

1、1.研究目的：
　　 癲癇(epilepsy)是一組由大腦神經(jīng)元異常放電所引起的短暫中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性腦部疾病，具有突然發(fā)生、反復(fù)發(fā)作的特點。這些異常放電的神經(jīng)元群被稱為癲癇灶。外傷性癲癇(Post-traumatic epilepsy，PTE)是一種以反復(fù)癇樣發(fā)作為特征的疾病，是腦外傷后常見的繼發(fā)性疾病，系因各種暴力作用于顱腦，致腦實質(zhì)發(fā)生繼發(fā)性損傷，產(chǎn)生癲癇病灶，引起癲癇發(fā)作。
　　 癲癇的病因異常復(fù)雜

2、，發(fā)病機制至今尚未完全闡明。但在神經(jīng)遞質(zhì)方面的研究較多，普遍認為癲癇發(fā)作與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)內(nèi)興奮性氨基酸與抑制性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的平衡失調(diào)密切相關(guān)[5]，這些遞質(zhì)的失衡使神經(jīng)元異常放電，神經(jīng)元放電頻率過高并無限制地向周圍神經(jīng)元擴散，導(dǎo)致癲癇發(fā)作。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)以γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)為代表的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)減少與以谷氨酸(glutamic acid

3、，Glu)為代表的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)增多是癲癇發(fā)生的主要機制之一，并且已得到證實。神經(jīng)遞質(zhì)要發(fā)揮效應(yīng)要通過相應(yīng)的受體來介導(dǎo)，因而目前國內(nèi)外的研究主要集中在其相應(yīng)受體的改變。國內(nèi)外已有GABAB受體和mGluR1在非外傷性癲癇動物模型或患者中的表達變化研究，并已證實它們在非外傷性癲癇發(fā)生發(fā)展中的作用；但尚未見到GABAB受體和mGluR1在人腦外傷性癲癇發(fā)病機制中所起作用的研究，它們在外傷性癲癇患者中是否也存在表達變化，以及表達的程度如何，是

4、本實驗研究的內(nèi)容與目的。
　　 本研究以外傷性癲癇、非外傷性癲癇病人癲癇灶手術(shù)切除標(biāo)本及非癲癇組腦組織為研究對象，首先用光鏡(HE染色)觀察三組標(biāo)本在形態(tài)學(xué)上的差別，接著用免疫熒光技術(shù)觀察三組標(biāo)本間mGluR1、GABABR1的表達差異，再用RT-PCR技術(shù)檢測上述各組mGluR1、GABABR1在mRNA水平是否也存在表達差異，并最后以Western-blot技術(shù)對mGluR1、GABABR1在蛋白水平進行定量檢測，本實驗通過

5、上述實驗設(shè)計試圖闡明mGluR1、GABABR1在外傷性癲癇發(fā)病機制中的作用，探索mGluR1和GABAB1R在外傷性癲癇中可能的臨床和法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。
　　 2.研究方法：
　　 本實驗共分為三組：外傷性癲癇組(腦外傷后繼發(fā)癲癇患者)15例、非外傷性癲癇組(原發(fā)性性癲癇患者)15例、非癲癇對照組(交通事故死亡者)15例。
　　 2.1對所收集的皮質(zhì)樣本均進行HE染色，鏡下觀察各組標(biāo)本形態(tài)學(xué)改變；
　　

6、2.2運用RT-PCR技術(shù)從分子水平比較各實驗組mGluR1和GABAB RlmRNA表達水平；
　　 2.3用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)和熒光免疫組化染色技術(shù)從蛋白水平定性觀察各實驗組mGluR1和GABAB R1對應(yīng)的蛋白表達水平；
　　 2.4運用western blot技術(shù)量化mGluR1和GABAB R1對應(yīng)的蛋白在各實驗組中的表達量，比較二者在外傷性癲癇組、非外傷性癲癇組和對照組中表達量的變化及差異。
　　

7、 3.研究結(jié)果：
　　 3.1HE染色觀察
　　 外傷性癲癇組和非外傷性癲癇組均存在神經(jīng)元數(shù)目減少，核固縮深染，突觸彎曲甚至呈螺旋狀，胞體縮小變形，細胞內(nèi)尼氏小體消失，胞漿變性、腫脹甚至呈空泡狀，染色呈深伊紅色，膠質(zhì)細胞明顯增生，并可見嗜神經(jīng)細胞現(xiàn)象(神經(jīng)元被膠質(zhì)細胞圍繞吞噬)及膠質(zhì)細胞結(jié)節(jié)。
　　 非癲癇組沒有觀察到明顯的神經(jīng)元數(shù)目減少及膠質(zhì)細胞增生等現(xiàn)象，但可以觀察到部分神經(jīng)組織水腫。
　　 3.2熒

8、光免疫組化染色結(jié)果
　　 3.2.1 mGluR1結(jié)果
　　 mGluR1蛋白紅色熒光在外傷性癲癇組表達明顯高于非癲癇對照組但低于非外傷性癲癇組，組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.2.2 GABAB R1結(jié)果
　　 GABAB R1蛋白綠色熒光在外傷性癲癇組表達明顯低于非癲癇對照組但高于非外傷性癲癇組，組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.3 RT-PC

9、R結(jié)果
　　 3.3.1 mGluR1結(jié)果
　　 mGluR1 mRNA在外傷性癲癇組表達水平明顯高于非癲癇對照組但低于非外傷性癲癇組，組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.3.2 GABAB R1結(jié)果
　　 GABABR1 mRNA在外傷性癲癇組表達水平明顯低于非癲癇對照組但高于非外傷性癲癇組，組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.4 western bl

10、ot結(jié)果
　　 3.4.1 mGluR1結(jié)果
　　 mGluR1蛋白在外傷性癲癇組表達水平明顯高于非癲癇對照組但低于非外傷性癲癇組，組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.4.2 GABAB R1結(jié)果
　　 GABAB R1蛋白在外傷性癲癇組表達水平明顯低于非癲癇對照組但高于非外傷性癲癇組，組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.研究結(jié)論：
　　 4.1

11、 HE染色結(jié)果分析顯示外傷性癲癇及非外傷性癲癇患者癲癇灶存在明顯的形態(tài)學(xué)改變，例如神經(jīng)元數(shù)目減少、膠質(zhì)細胞增生、神經(jīng)元變性、嗜神經(jīng)現(xiàn)象甚至膠質(zhì)小結(jié)的形成等，以上特征性改變在非癲癇組中十分少見。因此，可以將以上特征性改變綜合起來運用到法醫(yī)學(xué)實際檢案之中，尤其是外傷性癲癇后經(jīng)手術(shù)治療的患者，本實驗所顯示的形態(tài)學(xué)改變可為外傷性癲癇的法醫(yī)學(xué)鑒定提供一定的客觀證據(jù)。
　　 4.2外傷性癲癇與非癲癇對照組相比，實驗結(jié)果顯示：在外傷性、非外傷

12、性癲癇灶中，GABABR1mRAN和蛋白存在低表達，mGluR1 mRAN和蛋白存在高表達，說明GABABR1、mGluR1參與外傷性、非外傷癲癇的發(fā)病過程，并且神經(jīng)遞質(zhì)及其受體的改變可能是導(dǎo)致外傷性癲癇發(fā)病原因之一。
　　 4.3非外傷性癲癇組與外傷性癲癇組相比，實驗結(jié)果顯示，非外傷性癲癇病人中mGluR1和GABABR1的表達變化程度大于外傷性癲癇病人，說明外傷是促使外傷性癲癇發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。
　　 4.4本