外傷性癲癇灶形態(tài)學(xué)與基因表達(dá)的研究.pdf

1、流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國癲癇的患病率為3.5‰～4.8‰，癲癇患者總數(shù)約1000萬。腦外傷(Traumatic brain injury；TBI)后發(fā)生癲癇的危險性比正常人群高3倍以上，是導(dǎo)致癲癇發(fā)作的主要因素之一。國內(nèi)報告外傷性癲癇患者占癲癇患者總數(shù)的14﹪～45﹪。外傷性癲癇(Post traumatic epilepsy；PTE)又稱腦外傷后癲癇，文獻(xiàn)報告腦外傷后外傷性癲癇的發(fā)生率為4﹪～53﹪。臨床上報道采用全數(shù)字化偶極子定位、三

2、維圖像融合長程視頻腦電監(jiān)測系統(tǒng)(癲癇刀)檢查定位癲癇灶，采用癲癇灶切除手術(shù)治療外傷性癲癇，術(shù)后有效率達(dá)100﹪，顯效率82﹪，但產(chǎn)生和維持癲癇灶局部神經(jīng)元高興奮性的分子機(jī)制并不清楚。學(xué)者們認(rèn)為癲癇病灶腦組織放電活性的生物學(xué)機(jī)制不清，很有可能與基因表達(dá)的變化有關(guān)。 本實驗觀察外傷性癲癇患者癲癇灶皮質(zhì)神經(jīng)系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)變化，結(jié)合利用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行量化指標(biāo)測定，分析探討外傷性癲癇的病理形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)；并利用基因芯片篩選外傷性癲癇灶與非外傷

3、性癲癇灶皮質(zhì)的差異表達(dá)基因，建立外傷性癲癇發(fā)生發(fā)展的基因表達(dá)譜，初步分析差異表達(dá)基因的功能及其與癲癇發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為外傷性癲癇的臨床治療及法醫(yī)學(xué)鑒定研究提供方向；分析差異表達(dá)基因結(jié)果的穩(wěn)定性，并結(jié)合外傷性癲癇的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)以及免疫組化指標(biāo)的測定，為外傷性癲癇的法醫(yī)學(xué)鑒定提供相關(guān)實驗指標(biāo)。 2．研究方法: 本實驗共收集癲癇患者癲癇灶皮質(zhì)30例，分為兩組，其中腦外傷后癲癇患者15例(外傷性癲癇組)、非腦外傷后癲癇患者15例(

4、非外傷性癲癇)，對應(yīng)于各癲癇灶的部位收集失血性休克死亡者腦皮質(zhì)共15例(對照組)。 2．1外傷性癲癇流行病學(xué)分析：針對文獻(xiàn)報導(dǎo)的外傷性癲癇的各種危險性因素，對本研究所收集的外傷性癲癇患者臨床病歷進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，為法醫(yī)學(xué)鑒定提供相關(guān)科學(xué)依據(jù)。 2．2形態(tài)學(xué)觀察：對所收集的標(biāo)本均進(jìn)行HE染色、電鏡和突觸素、NOGO-A、膠質(zhì)纖維酸性蛋白免疫組化染色觀察；采用圖像分析系統(tǒng)對神經(jīng)元形態(tài)、細(xì)胞器形態(tài)及免疫組化指標(biāo)進(jìn)行量化指標(biāo)測定。

5、 2．3基因芯片觀察外傷后癲癇差異表達(dá)基因：首先提取所收集外傷性癲癇組與非外傷性癲癇組的癲癇灶皮質(zhì)總RNA，質(zhì)量檢測合格后經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記不同的探針與人類cDNA表達(dá)譜芯片雜交，將雜交結(jié)果掃描得到的圖像重疊，由ImageGene310軟件分析信號的強(qiáng)度和比值，實驗數(shù)據(jù)按照RMA微陣列分析法標(biāo)準(zhǔn)化，采用IBM開發(fā)的Genes work對差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析。 3．研究結(jié)果: 3．1外傷性癲癇的流行病學(xué)分析外傷性癲癇

6、患者男女比例之間沒有顯著差別，癲癇灶部位多見于顳葉和額葉；功能區(qū)局灶性腦挫裂傷引起的局灶性皮層腦出血是外傷后發(fā)生癲癇的重要危險因素。本研究中外傷性癲癇患者中CT未見明顯病灶者占60﹪，說明外傷性癲癇患者CT等影像學(xué)檢查并不一定能夠檢測到癲癇病灶，神經(jīng)系統(tǒng)查體有70﹪的患者未見明顯體征。術(shù)后對病人進(jìn)行隨訪，根據(jù)Engel分級，Ⅰ級23例，Ⅱ級15例，Ⅲ級7例，無Ⅳ級患者。外傷性癲癇患者采用癲癇灶切除的外科治療，病程超過20年以上者，遠(yuǎn)期療

7、效Engel分級評價差于病程較短患者。 3．2 HE染色結(jié)果與對照組比較，外傷性癲癇灶皮質(zhì)樣本均顯示不同程度的神經(jīng)細(xì)胞核固縮，胞體縮小變形，尼氏小體消失，胞漿變性、腫脹甚至呈空泡狀，染色呈深伊紅色，并可見嗜神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象(壞死的神經(jīng)細(xì)胞被增生的小膠質(zhì)細(xì)胞圍繞吞噬)及小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)節(jié)。 3．3電鏡觀察結(jié)果外傷性癲癇灶有明顯的超微結(jié)構(gòu)變化，神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，神經(jīng)元細(xì)胞大多濃縮，胞核變形，核膜皺縮，線粒體腫脹，嵴斷裂、模糊，核糖體解聚，

8、脂褐素增多；突觸前膜及突觸后膜均發(fā)生不同程度的水腫，突觸間隙變寬，模糊不清；星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)水腫，胞核皺縮、深染；皮質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管扭曲、堵塞或內(nèi)皮細(xì)胞水腫，突入管腔，基底膜增厚或分層；髓鞘結(jié)構(gòu)排列紊亂，呈脫髓鞘改變。 3．4免疫組化染色結(jié)果1)突觸素：外傷性癲癇組與非外傷性癲癇組神經(jīng)元胞漿中均出現(xiàn)表達(dá)，外傷性癲癇組的表達(dá)與非外傷性癲癇組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但與對照組(表達(dá)不明顯)比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；

9、 2)NOGO-A：外傷性癲癇組與非外傷性癲癇組神經(jīng)元胞漿中均出現(xiàn)表達(dá)，且外傷性癲癇組的表達(dá)更為顯著(P<0.05)，與對照組(表達(dá)不明顯)比較也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 3)膠質(zhì)纖維酸性蛋白：外傷性癲癇組、非外傷性癲癇組與對照組膠質(zhì)細(xì)胞中均出現(xiàn)表達(dá)，外傷性癲癇組的表達(dá)與非外傷性癲癇組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。(以上統(tǒng)計方法為兩樣本均數(shù)t檢驗)。 3.5基因

10、芯片結(jié)果與非外傷性癲癇組比較，外傷性癲癇組樣品中存在顯著性表達(dá)差異的基因有192個，其中表達(dá)上調(diào)的有115個，表達(dá)下調(diào)的有77個，主要包括神經(jīng)功能相關(guān)基因、免疫相關(guān)基因、蛋白代謝(轉(zhuǎn)運、磷酸化及水解)相關(guān)基因、細(xì)胞凋亡與增殖分化相關(guān)基因以及信號傳導(dǎo)相關(guān)基因等。 4．研究結(jié)論: 1)腦挫裂傷及腦出血是外傷性癲癇的重要危險因素之一，但是仍有20﹪的外傷性癲癇患者未見腦出血或腦挫裂傷，40﹪的外傷性癲癇患者CT未見明顯病灶，這

11、些未見腦出血及腦挫裂傷、CT未見明顯病灶的外傷性癲癇患者在法醫(yī)學(xué)鑒定中經(jīng)常引發(fā)爭議。 2)組織學(xué)染色結(jié)果分析及電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察顯示外傷性癲癇患者癲癇灶存在明顯的形態(tài)學(xué)改變。與非外傷性癲癇組比較，外傷性癲癇組患者癲癇灶神經(jīng)元凋亡的形態(tài)學(xué)特征更為明顯。 3)外傷性癲癇組與非外傷性癲癇組癲癇灶皮質(zhì)樣本之間存在的192條差異表達(dá)基因，主要包括神經(jīng)功能相關(guān)基因、蛋白代謝(轉(zhuǎn)運、磷酸化及水解)相關(guān)基因、細(xì)胞凋亡與增殖分化相關(guān)基因以及