外傷性癲癇與凋亡基因bcl-2、caspase-10相關(guān)性的研究.pdf

1、1.研究目的: 外傷性癲癇(Post traumatlc epilepsy；PTE)是繼發(fā)于顱腦損傷后引起的癲癇發(fā)作，是顱腦損傷后一種常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥，可發(fā)生于顱腦外傷后的任何時(shí)間。既可以在腦外傷后即刻發(fā)作，也可以于腦外傷痊愈后數(shù)年發(fā)作。由于癲癇發(fā)病距外傷時(shí)間長(zhǎng)短不一，部分案例缺乏明顯外傷性影像學(xué)改變，客觀鑒定依據(jù)不足，在檢案中被鑒定人所患癲癇與外傷的關(guān)系常引發(fā)爭(zhēng)議，成為法醫(yī)鑒定工作中的難點(diǎn)之一；外傷性癲癇也是臨床久治不愈反復(fù)發(fā)

2、作的疑難疾病，目前對(duì)它的發(fā)病機(jī)制也不是很清楚。因此有必要對(duì)此進(jìn)行深入的研究，以獲得相關(guān)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為法醫(yī)學(xué)鑒定提供依據(jù)，也為臨床治療提供理論基礎(chǔ)。 Bcl-2基因族和caspase基因族是近年相繼發(fā)現(xiàn)的兩類(lèi)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的基因族，它們?cè)诩?xì)胞凋亡發(fā)生的不同階段起不同的調(diào)控作用。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究已經(jīng)證實(shí)，創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury；TBI)后存在細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)，特別在bcl-2基因族中

3、bcl-2和caspase基因族中caspase-10基因的表達(dá)。外傷性癲癇是由顱腦外傷后發(fā)展而來(lái)，既然腦外傷后存在細(xì)胞凋亡基因bcl-2和caspase-10的表達(dá)，是否外傷性癲癇也存在這些基因的表達(dá)，以及表達(dá)的程度如何，目前有關(guān)細(xì)胞凋亡基因bcl-2和caspase-10在人體外傷性癲癇灶皮質(zhì)神經(jīng)元中的表達(dá)的研究仍屬于空白。因此本實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用RT—PCR、western blot、免疫組化和熒光免疫組化等方法探索細(xì)胞凋亡基因bcl-2

4、和caspase-10在原發(fā)性癲癇和外傷性癲癇病人腦組織標(biāo)本中的表達(dá)情況，并將其與正常腦組織中的表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較和分析，探討其法醫(yī)學(xué)意義和臨床意義，以期為闡明外傷性癲癇的發(fā)病機(jī)制，為外傷性癲癇法醫(yī)鑒定提供新的依據(jù)，也為臨床治療外傷性癲癇提供理論基礎(chǔ)和支持。 2.研究方法: 本實(shí)驗(yàn)共分為三組：外傷性癲癇組(腦外傷后繼發(fā)癲癇患者)15例、非外傷性癲癇組(非外傷性癲癇患者)15例、空白對(duì)照組(交通事故死亡者)15例。

5、 2.1對(duì)所收集的皮質(zhì)樣本均進(jìn)HE染色，鏡下觀察各組標(biāo)本的形態(tài)學(xué)改變； 2.2運(yùn)用RT—PCR技術(shù)從分子水平比較各實(shí)驗(yàn)組凋亡基因表達(dá)的水平； 2.3用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)和熒光免疫組化染色技術(shù)從蛋白水平定性觀察各實(shí)驗(yàn)組凋亡基因?qū)?yīng)的蛋白表達(dá)水平； 2.4運(yùn)用westernblot技術(shù)量化凋亡基因?qū)?yīng)的蛋白在各實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量，比較二者在外傷性癲癇組、非外傷性癲癇組和對(duì)照組中表達(dá)量的變化及差異。 3.

6、研究結(jié)果: 3.1HE染色結(jié)果外傷性癲癇組、非外傷性癲癇組所有標(biāo)本均顯示不同程度的神經(jīng)細(xì)胞核固縮，胞體縮小變形，尼氏小體消失，胞漿變性、腫脹甚至呈空泡狀，染色呈深伊紅色，并可見(jiàn)嗜神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象(壞死的神經(jīng)細(xì)胞被增生的小膠質(zhì)細(xì)胞圍繞吞噬)及小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)節(jié)?？瞻讓?duì)照組神經(jīng)元胞漿水腫，細(xì)胞核染色呈深伊紅色。 3.2RT—PCR結(jié)果1)Bcl—2：Bcl—2mRNA在外傷性癲癇組表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0

7、.05)；Bcl—2mRNA在非外傷性癲癇組表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Bcl—2mRNA在非外傷性癲癇組明顯高于外傷性癲癇組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2)Caspase-10：Caspase-10mRNA在外傷性癲癇組表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Caspase-10mRNA在非外傷性癲癇組表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

8、5)；Caspase-10mRNA在外傷性癲癇組明顯高于非外傷性癲癇組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3.3免疫組化染色結(jié)果1)Bcl—2：Bcl—2主要在外傷性癲癇組與非外傷性癲癇組癲癇灶皮質(zhì)的神經(jīng)元胞漿中表達(dá)，對(duì)照組中未見(jiàn)明顯表達(dá)；與外傷性癲癇組比較，非外傷性癲癇組表達(dá)顯著增高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2)Caspase-10：Caspase-10主要在外傷性癲癇組與非外傷性癲癇組癲癇灶皮質(zhì)

9、的神經(jīng)元胞漿中表達(dá)，對(duì)照組中未見(jiàn)明顯表達(dá)；與非外傷性癲癇組比較，外傷性癲癇組caspase-10表達(dá)顯著增高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3.4熒光免疫組化染色結(jié)果1)Bcl—2：Bcl—2以CY3紅色熒光標(biāo)記，Bcl—2在外傷性癲癇組表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在非外傷性癲癇組表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在非外傷性癲癇組表達(dá)明顯高于外傷性癲癇組，差異有顯著

10、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2)Caspase-10：Caspase-10以FITC綠色熒光標(biāo)記，Caspase-10在外傷性癲癇組表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在非外傷性癲癇組表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在外傷性癲癇組表達(dá)明顯高于非外傷性癲癇組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3.5westernblot結(jié)果1)Bcl—2：Bcl—2在外傷性癲癇組表達(dá)

11、明顯高于對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Bcl—2在非外傷性癲癇組表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Bcl—2在非外傷性癲癇組表達(dá)明顯高于外傷性癲癇組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2)Caspase-10：Caspase-10在外傷性癲癇組表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Caspase-10在非外傷性癲癇組表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0

12、.05)；Caspase-10在外傷性癲癇組表達(dá)明顯高于非外傷性癲癇組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 4.研究結(jié)論: 1、在外傷性癲癇灶中，發(fā)現(xiàn)有神經(jīng)元凋亡和膠質(zhì)細(xì)胞大量增生的現(xiàn)象。 2、在外傷性癲癇灶中，抑制凋亡的bcl—2基因及其蛋白存在著低表達(dá)和促進(jìn)凋亡的caspase-10基因及其蛋白存在著高低表達(dá)，caspase-10、bcl—2基因參與外傷性癲癇的發(fā)病過(guò)程，神經(jīng)元凋亡可能是導(dǎo)致外傷性癲癇發(fā)病