垂體腺瘤中NPY、miR-15a-miR-16和Bcl-2相關(guān)性研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步研究無功能垂體腺瘤細(xì)胞（αT3細(xì)胞）中 NPY、miR-15a/miR-16和Bcl-2之間的相互關(guān)系，及NPY、miR-15a/miR-16、Bcl-2各自在96 h內(nèi)的變化規(guī)律，同時(shí)觀察無功能垂體腺瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期變化。以期探討 NPY、miR-15a/miR-16和 Bcl-2之間的相互關(guān)系及其對無功能垂體腺瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展的影響。進(jìn)而深入了解NPY在垂體腺瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，從另一視角探討垂體腺瘤的發(fā)

2、病機(jī)制，或許對現(xiàn)有理論進(jìn)行補(bǔ)充，為垂體腺瘤的基因治療增加新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　內(nèi)容：本實(shí)驗(yàn)對αT3細(xì)胞進(jìn)行分組培養(yǎng)，各組給予不同干預(yù)措施，觀察各組（Ⅰ~Ⅸ）αT3細(xì)胞中各時(shí)間點(diǎn)NPY、miR-15a/miR-16和Bcl-2在基因和蛋白水平的表達(dá)情況，以及各組（Ⅰ~Ⅲ，Ⅷ、Ⅸ）各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖活性的相應(yīng)改變。最后對各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較，得出結(jié)論。
　　方法：
　　1.細(xì)胞來源：無功能垂體腺瘤細(xì)胞

3、系（αT3細(xì)胞）由北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科實(shí)驗(yàn)室提供。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組：Ⅰ空白對照組；Ⅱ NPY增強(qiáng)劑組；Ⅲ NPY拮抗劑組；Ⅳ化學(xué)合成針對miR-15a反義核酸分子轉(zhuǎn)染垂體瘤細(xì)胞組；Ⅴ攜帶miR-15a脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染垂體瘤細(xì)胞組；Ⅵ化學(xué)合成針對 miR-16反義核酸分子轉(zhuǎn)染垂體瘤細(xì)胞組；Ⅶ攜帶miR-16脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染垂體瘤細(xì)胞組；Ⅷ NPY增強(qiáng)劑和攜帶miR-15a脂質(zhì)體干預(yù)組；Ⅸ NPY增強(qiáng)劑和攜帶miR-16脂質(zhì)體干預(yù)組。
　

4、　3.各組分別在0 h、24 h、48 h、72 h、96 h應(yīng)用RTFQ-PCR和Western Blot檢測NPY mRNA、miR-15a、miR-16、Bcl-2 mRNA和NPY、Bcl-2等六項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)，分析各指標(biāo)變化趨勢、變化特點(diǎn)及相互之間的關(guān)系，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　4.于0 h、48 h、72 h、96 h對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅷ、Ⅸ組分別應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，MTT法檢測細(xì)胞增殖活性，分別觀察與NPY和Bcl

5、-2之間的關(guān)系，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.NPY增強(qiáng)劑/拮抗劑干預(yù)后，NPY mRNA、NPY與Bcl-2 mRNA、Bcl-2表達(dá)均較空白對照組升高/降低，各組中 NPY與 Bcl-2呈同向表達(dá)趨勢。NPY與miR-15a/miR-16呈負(fù)向表達(dá)。
　　2.上調(diào)miR-15a/miR-16后，NPY mRNA、NPY和Bcl-2 mRNA、Bcl-2表達(dá)較空白對照組降低或無明顯變化，整體上miR-15a

6、/miR-16與Bcl-2 mRNA、Bcl-2呈負(fù)向表達(dá)。
　　3.下調(diào)miR-15a/miR-16后，NPY mRNA、NPY和Bcl-2 mRNA、Bcl-2表達(dá)較空白對照組增高或無明顯變化，整體上miR-15a/miR-16與Bcl-2 mRNA、Bcl-2呈負(fù)向表達(dá)。
　　4.同時(shí)予以NPY增強(qiáng)劑及上調(diào)miR-15a/miR-16后Bcl-2 mRNA和Bcl-2表達(dá)比單獨(dú)應(yīng)用NPY增強(qiáng)劑時(shí)低，比單獨(dú)上調(diào)miR-1

7、5a/miR-16后高。
　　5.NPY、Bcl-2表達(dá)增高時(shí)αT3細(xì)胞周期趨向分裂期改變；NPY、Bcl-2表達(dá)降低時(shí)αT3細(xì)胞趨向細(xì)胞周期阻滯。Ⅷ、Ⅸ組G1期細(xì)胞比例較Ⅰ組合Ⅱ組大，較Ⅲ組小。
　　6.Ⅱ組的NPY表達(dá)和αT3細(xì)胞增殖活性存在顯著線性正相關(guān)關(guān)系；Bcl-2也與αT3細(xì)胞增殖活性呈正向關(guān)系。Ⅷ、Ⅸ組αT3細(xì)胞增殖活性較Ⅰ組和Ⅱ組低，比Ⅲ組高。
　　結(jié)論：
　　1.各組中NPY與Bcl-2呈同向表

8、達(dá)趨勢，NPY與miR-15a/miR-16呈負(fù)向表達(dá)，在NPY增強(qiáng)干預(yù)組內(nèi)，miR-15a/miR-16與Bcl-2呈線性負(fù)相關(guān)關(guān)系。推測NPY可能通過作用于miR-15a/miR-16正向調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)。
　　2.整體上miR-15a/miR-16與Bcl-2 mRNA、Bcl-2呈負(fù)向表達(dá)， miR-15a/miR-16對NPY mRNA和NPY的負(fù)向作用輕微。
　　3.Ⅷ、Ⅸ組結(jié)果表明Bcl-2可能同時(shí)受到NP

9、Y與miR-15a/miR-16的影響，更支持NPY可能通過影響miR-15a/miR-16進(jìn)而改變Bcl-2的表達(dá)。
　　4.NPY和Bcl-2可能與αT3細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖活性有關(guān)。拮抗NPY表達(dá)后細(xì)胞增殖活性降低，提示拮抗NPY有可能成為治療垂體腺瘤的方式之一。
　　5.實(shí)驗(yàn)表明Bcl-2可在早期受到來自被NPY抑制表達(dá)的 miR-15a/miR-16的作用；持續(xù)表達(dá)增強(qiáng)的Bcl-2與αT3細(xì)胞的G1期細(xì)胞比例表現(xiàn)為負(fù)