SIAH2與Bcl-2在乳腺癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究.pdf

1、前言:乳腺癌是女性一種常見的惡性腫瘤,已成為女性腫瘤患者死亡的主要原因。乳腺癌的發(fā)生經(jīng)歷了以下幾個階段:正常導(dǎo)管上皮→普通型導(dǎo)管上皮增生→不典型導(dǎo)管上皮增生→導(dǎo)管原位癌→浸潤性導(dǎo)管癌,探討與乳腺癌動態(tài)發(fā)展過程相關(guān)基因的改變對治療乳腺癌具有重要意義。
　　 SIAH2蛋白具有E3泛素連接酶的活性,可調(diào)節(jié)一些蛋白的泛素化和降解,這些蛋白包括DCC,Bag-1,TRAF2,PHD1/3,Spry2等。近來發(fā)現(xiàn)SIAH2可作為一種重要的

2、腫瘤因子發(fā)揮生物學(xué)作用,SIAH2在有增殖能力的細(xì)胞中表達(dá)(正常和瘤細(xì)胞),如宮頸癌細(xì)胞,乳腺癌細(xì)胞,人胚腎細(xì)胞及結(jié)直腸腺瘤組織等,而在不增殖的細(xì)胞中表達(dá)缺失。研究報導(dǎo)抑制SIAH2的功能后能夠阻斷ERK信號通路,抑制軟瓊脂中胰腺癌細(xì)胞的自主生長和裸鼠體內(nèi)胰腺腫瘤的形成,最近研究發(fā)現(xiàn)SIAH2在幾乎所有類型肺癌組織中均有表達(dá),并且隨著肺癌分化程度的降低SIAH2的表達(dá)顯著增加,而在正常肺組織中幾乎不表達(dá)。Bcl-2是程序性細(xì)胞死亡的關(guān)鍵

3、調(diào)節(jié)因子,它既能夠與自身形成同源二聚體,也可以與Bcl-2家族其他蛋白形成異源二聚體。眾所周知Bcl-2能夠有效抑制Bax的凋亡作用,Bcl-2通過與Bak相互作用抑制Bax的構(gòu)象改變,并且能夠阻止Bax從胞漿到線粒體膜的易位,從而抑制細(xì)胞凋亡。
　　 最近有研究發(fā)現(xiàn)抑制SIAH2的功能可以使其底物蛋白Spry2水平上調(diào)從而抑制ERK的磷酸化,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡。而PD98059抑制ERK的活性后能夠下調(diào)Bcl-2的表達(dá)。所

4、以我們推測SIAH2可能通過ERK通路來調(diào)控Bcl-2,本研究目的旨在探討乳腺組織及細(xì)胞系中SIAH2和Bcl-2的表達(dá)情況及與臨床病理學(xué)參數(shù)的意義,探討在乳腺癌細(xì)胞中干擾SIAH2的功能后Bcl-2表達(dá)的變化。
　　 材料與方法:
　　 1、材料
　　 180例乳腺組織標(biāo)本(包括33例正常乳腺組織,28例乳腺不典型增生組織,39例乳腺導(dǎo)管原位癌組織和80例乳腺浸澗性導(dǎo)管癌組織),均取自中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院2

5、007-2009年腫瘤外科手術(shù)切除的標(biāo)本,所有患者術(shù)前均未接受放、化療。標(biāo)本經(jīng)4％中性甲醛固定,石蠟包埋,HE常規(guī)染色后明確診斷。其中部分癌組織和正常乳腺組織離體后立即放入液氮后-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?株乳腺癌癌細(xì)胞系(MDA-MB-435S和MCF7),1株人乳腺正常上皮細(xì)胞系(MCF-10A)。用含10％新鮮胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37℃,5％CO2的條件下培養(yǎng)。
　　 2、主要試劑和來源SIAH2鼠單克隆抗體,SIAH

6、2 siRNA,Bcl-2鼠單克隆抗體均購自美國SantaCruz公司。SP免疫組化試劑盒和DAB酶底物顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。
　　 3、方法
　　 (1)免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定標(biāo)本固定,石蠟包埋,制成4μm連續(xù)切片,采用鏈菌素抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組化法(S-P法)檢測SIAH2和Bcl-2蛋白表達(dá)。以PBS緩沖液代替一抗為陰性對照。結(jié)果判定:SIAH2以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色,B

7、cl-2以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色。高倍視野(×400)下選陽性信號最強區(qū)域計數(shù)200個腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù),根據(jù)免疫組化染色強度分為三個等級:淺黃色計為1分,棕黃色計為2分,黃褐色計為3分。按SIAH2和Bcl-2表達(dá)百分率分為以下四個等級:0％為0分,1％-50％為1分,51％-75％為2分,＞75％為3分。以染色強度和陽性細(xì)胞率的分值乘積作為每一例的積分,積分＜4者判定為陰性,積分≥4為陽性。
　　 (2)West

8、ern Blot在收集的細(xì)胞內(nèi)加入裂解液充分裂解,低溫高速離心(4℃,15000轉(zhuǎn)/min,30min),提取上清為總蛋白。上樣蛋白量為60μg。電泳(12％SDS-PAGE凝膠)、轉(zhuǎn)印至PVDF膜、封閉,一抗SIAH2(1:200)、Bcl-2(1:200)和β-actin(1:200),4℃孵育過夜,分別與各自對應(yīng)的二抗(1:4000)室溫孵育2小時,ECL顯色,結(jié)果經(jīng)自動凝膠成像分析儀采集,進(jìn)行灰度值測定,β-actin做內(nèi)參。<

9、br>　　 (3)siRNA干擾實驗分三組:空白對照組、非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組和特異性siRNA轉(zhuǎn)染組,每個實驗均重復(fù)三次,轉(zhuǎn)染具體步驟按Lipofect2000試劑說明書進(jìn)行。
　　 4、統(tǒng)計分析
　　 各組資料應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、免疫組織化學(xué)結(jié)果SIAH2蛋白主要在細(xì)胞核表達(dá),Bcl-2蛋白主要在細(xì)胞漿表達(dá)。在乳腺癌癌變過

10、程(正常乳腺組織,不典型導(dǎo)管增生,導(dǎo)管原位癌,浸潤性導(dǎo)管癌)中SIAH2和Bcl-2蛋白的陽性表達(dá)率呈逐漸升高趨勢。兩者表達(dá)水平均與乳腺癌組織學(xué)分級明顯相關(guān)。在80利乳腺癌中SIAH2與Bcl-2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。
　　 2、Westem Blot結(jié)果SIAH2蛋白和Bcl-2蛋白在乳腺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于正常乳腺組織及細(xì)胞系,用SIAH2siRNA干擾乳腺癌細(xì)胞系MCF7和MDA-MB435S中SIAH2的功能后Bc