BDNF、GDNF在外傷性癲癇病人腦組織中表達(dá)的研究.pdf

1、研究目的： 外傷性癲癇是顱腦損傷后常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，顱腦損傷是臨床醫(yī)學(xué)及法醫(yī)學(xué)上十分常見的損傷，而且隨著社會(huì)發(fā)展其發(fā)生率逐年升高。顱腦外傷后癲癇的發(fā)生率隨著損傷后研究的時(shí)間不同、研究人群的年齡和原發(fā)性損傷的嚴(yán)重程度差異而變化。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)外傷性癲癇的研究尚不深入，其發(fā)病機(jī)制尚未闡明。外傷性癲癇的法醫(yī)學(xué)鑒定是目前實(shí)際檢案的難點(diǎn)，尤其是影像學(xué)上未見明顯病灶的顱腦外傷后引發(fā)的癲癇，在法醫(yī)學(xué)鑒定中經(jīng)常引起爭(zhēng)議。對(duì)法醫(yī)學(xué)家而言，如何

2、確定癲癇與外傷的關(guān)系、外傷究竟是誘發(fā)因素還是直接因素、顱腦外傷對(duì)癲癇的損傷參與度等仍然是需要深入研究的課題。研究外傷性癲癇的發(fā)病機(jī)制對(duì)以上問題的解決具有重要意義。 BDNF和GDNF可以對(duì)受損傷的神經(jīng)元起正向的修復(fù)作用，參與神經(jīng)突觸重建過程，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，注入BDNF、GDNF或者導(dǎo)入二者cDNA以增加其表達(dá)可以有效修復(fù)受損神經(jīng)細(xì)胞，但目前對(duì)二者的突觸重建研究，多集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和外周神經(jīng)損傷等方面，對(duì)癲癇病人，特別是外傷性癲癇病

3、人標(biāo)本的研究尚罕見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬在前人相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，用western blot和免疫組化的方法探索BDNF和GDNF在原發(fā)性癲癇和外傷性癲癇病人腦組織標(biāo)本中的表達(dá)情況，并將其與正常腦組織中的表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比，探討其法醫(yī)學(xué)意義，以期為闡明癲癇發(fā)病機(jī)制及為外傷性癲癇法醫(yī)鑒定提供新的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究方法本實(shí)驗(yàn)分為三組，共收集75例腦皮質(zhì)樣本。其中腦外傷后癲癇灶皮質(zhì)30例(外傷性癲癇實(shí)驗(yàn)組)、非腦外傷后癲癇灶皮質(zhì)30例(非外傷性癲癇組)

4、，對(duì)應(yīng)于各癲癇灶的部位收集失血性休克死亡者腦皮質(zhì)共15例(對(duì)照組)。 實(shí)驗(yàn)研究方法如下： 第一，對(duì)所收集的皮質(zhì)樣本均進(jìn)行HE染色，鏡下觀察各組標(biāo)本的形態(tài)學(xué)改變。 第二，對(duì)各組樣本進(jìn)行腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神營(yíng)養(yǎng)因子免疫組化染色觀察；采用圖像分析系統(tǒng)對(duì)神經(jīng)元形態(tài)、免疫組化指標(biāo)進(jìn)行量化指標(biāo)測(cè)定。 第三，運(yùn)用western blot技術(shù)量化腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神營(yíng)養(yǎng)因子在各組標(biāo)本中的表達(dá)量

5、，精確比較二者在外傷性癲癇組、非外傷性癲癇組和對(duì)照組中表達(dá)量的變化及差異。 研究結(jié)果： 1、HE染色結(jié)果 外傷性癲癇組和非外傷性癲癇組均存在神經(jīng)細(xì)胞核固縮，神經(jīng)軸突彎曲甚至呈螺旋狀，胞體縮小變形，胞體周圍有水腫造成的空隙，細(xì)胞內(nèi)尼氏小體消失，胞漿變性、腫脹甚至呈空泡狀，染色呈深伊紅色，膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生，并可見嗜神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象(壞死的神經(jīng)細(xì)胞被增生的小膠質(zhì)細(xì)胞圍繞吞噬)及小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)節(jié)。 對(duì)照組有部分神經(jīng)細(xì)胞

6、核固縮，深染，胞體縮小變形，部分細(xì)胞內(nèi)尼氏小體消失，胞漿變性，染色呈深伊紅色。 2、免疫組織化學(xué)染色 1)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)主要在外傷性癲癇組與非外傷性癲癇組癲癇灶皮質(zhì)的神經(jīng)細(xì)胞胞漿中表達(dá)，對(duì)照組中微量表達(dá)；與對(duì)照組比較，外傷組癲癇組BDNF表達(dá)顯著增高；與非外傷性癲癇組比較，外傷性癲癇組BDNF的表達(dá)增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)主要在外傷性癲癇組與非外傷性癲癇組癲癇灶

7、皮質(zhì)的神經(jīng)細(xì)胞胞漿中表達(dá)，對(duì)照組中微量表達(dá)；與對(duì)照組比較，外傷組癲癇組GDNF表達(dá)顯著增高；與非外傷性癲癇組比較，外傷性癲癇組GDNF的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3、western blot結(jié)果 1)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)在外傷性癲癇組和非外傷性癲癇組表達(dá)量增加，對(duì)照組微量表達(dá)，蛋白條帶位于13.5KD處。 2)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)在外傷性癲癇組和非外傷性癲癇組表達(dá)量增加，對(duì)照組微量表達(dá)，蛋白條

8、帶位于15KD處。 4、計(jì)算機(jī)圖像分析和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果外傷性癲癇組BDNF表達(dá)的陽(yáng)性指數(shù)是4.339±1.738，非外傷性癲癇組BDNF表達(dá)的陽(yáng)性指數(shù)是0.5137±0.0076，對(duì)照組BDNF表達(dá)的陽(yáng)性指數(shù)是0.056±0.0004，外傷性癲癇組與對(duì)照組t檢驗(yàn)結(jié)果：t=11.307，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；外傷性癲癇組與非外傷性癲癇組t檢驗(yàn)結(jié)果：t=5.652，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 外傷性癲癇組GDNF表達(dá)的

9、陽(yáng)性指數(shù)是1.8839±0.6279，非外傷性癲癇組GDNF表達(dá)的陽(yáng)性指數(shù)是0.6071±0.0107，對(duì)照組GDNF表達(dá)的陽(yáng)性指數(shù)是0.2532±0.0032，外傷性癲癇組與對(duì)照組t檢驗(yàn)結(jié)果：t=7.1 104，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；外傷性癲癇組與非外傷性癲癇組t檢驗(yàn)結(jié)果：t=5.5347，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)論： 1、HE染色結(jié)果分析顯示外傷性癲癇及非外傷性癲癇患者癲癇灶存在明顯的形態(tài)學(xué)改變，例