D-半乳糖致衰老小鼠腦內mGluR1α與GLT的變化.pdf

1、D-半乳糖是一種生理性營養(yǎng)成分,在正常機體代謝中可轉變?yōu)槠咸烟?參與葡萄糖代謝,但過量供給會導致代謝紊亂。在一定時間內,連續(xù)給動物注射大劑量D-半乳糖,引起與自然衰老相似的生化改變、免疫功能低下、基因表達與調控異常、細胞生長繁殖能力下降、細胞退行性改變及認知障礙等表現(xiàn)。D-半乳糖衰老模型在一定程度上較好地模擬了自然衰老的改變,因此被廣泛應用于衰老、腦老化和相關藥物篩查的研究領域。目前,由D-半乳糖誘導的衰老模型已逐漸用于衰老機制、老年病

2、及抗衰老藥物篩選等方面的研究。
　　 谷氨酸(glutamate,Glu)作為組成人體生化代謝的氨基酸之一,在腦中參與蛋白質、多肽以及脂肪酸的合成,也參與三羧酸循環(huán),同時也是腦內最主要的興奮性神經遞質,是中樞神經系統(tǒng)(CNS)中含量最高的一種氨基酸,主要存在于大腦皮質、海馬、小腦、紋狀體;mGluR1α屬于第一組代謝型谷氨酸受體(metabotropic gluatamate receptor,mGluR),位于突觸后膜上,在腦

3、內分布廣泛,其中大腦皮質和海馬的受體密度最高,間腦和中腦等部位則較低。被激活后參與快速的興奮性突觸傳遞,調節(jié)神經遞質的釋放、突觸的可塑性、突觸長時程增強和長時程抑制以及學習和記憶等中樞神經系統(tǒng)正常的生理功能,可增強離子型谷氨酸受體(ionotropicgluatamate receptor,iGluR)介導的興奮性毒性;GLT(EAAT2)為五種谷氨酸轉運體(glutamate ransporter,EAAT)中的一種,是一種載體蛋白,

4、位于神經膠質細胞和神經元的胞膜上,主要表達于前腦、海馬、大腦皮層和紋狀體等部位,參與谷氨酸重攝取、控制胞外谷氨酸濃度。防止興奮毒性主要是由GLT-1和GLAST(EAAT1)完成。
　　 衰老和腦老化模型是研究衰老和腦老化的表現(xiàn)、機制以及篩選延緩衰老藥物的重要手段,也是目前老年醫(yī)學亟待解決的問題。研究表明D-半乳糖擬衰老模型在大鼠和小鼠等實驗動物上都表現(xiàn)出與人類自然衰老相似的病理生理改變,表現(xiàn)有生化指標異常,免疫功能降低,基因調

5、控與表達異常,細胞生長繁殖能力下降及細胞退行性變,大鼠操作性記憶鞏固與再現(xiàn)障礙等。但是對該模型致衰老的機理研究各家說法不一,有學者認為是D-半乳糖醇中毒所致,另一部分學者則認為D-半乳糖在代謝過程中誘發(fā)機體產生氧應激態(tài),超載的自由基是其致衰老的主要原因。
　　 黑質.紋狀體系統(tǒng)中主要是多巴胺能神經元,多巴胺(dopamine,DA)是錐體外系的重要遞質,因此它與軀體運動有密切關系。加強多巴胺能神經元的活動導致運動功能增強。相反,

6、削弱多巴胺能神經元活動使運動功能降低。海馬的三突觸回路是海馬長時程增強電生理效應的神經基礎,而長時程增強正是記憶產生的神經機制。在黑質-紋狀體和海馬都有谷氨酸能神經元及纖維投射分布。因此,黑質-尾殼核和海馬谷氨酸體系的改變,可以導致黑質-尾殼核和海馬神經元損傷、功能障礙,從而引起模型鼠行為的改變和認知的障礙。
　　 目的:本研究利用HE染色、尼氏染色以及免疫組織化學技術,觀察D-半乳糖處理昆明小鼠黑質神經元數量的變化,以及黑質-

7、尾殼核和海馬mGluR1α僅、GLT免疫反應強度的變化,探討D-半乳糖處理對昆明小鼠mGluR1α、GLT表達的影響,從形態(tài)學水平了解D-半乳糖擬衰老模型的遞質受體及轉運體功能狀況,以探討其可能的作用機制。
　　 方法:選用健康雄性昆明小鼠,隨機分為實驗組和對照組,實驗組(D-galactose,D-gal)背部皮下注射D-半乳糖(60mg/Kg/d);對照組(control,Con)小鼠相同部位注射等量生理鹽水。給藥6周后以形

8、態(tài)學方法檢測小鼠腦內黑質神經元數量變化,以及mGluR1α、GLT在各個部位的表達改變。
　　 結果:1.黑質細胞計數結果:長期D-半乳糖處理可導致小鼠中腦黑質神經元數量減少。在本實驗HE染色和尼氏染色黑質細胞計數結果中,D-半乳糖處理組為27.78±4.77,對照組為35.28±9.45,D-半乳糖處理組小鼠黑質神經元數量明顯低于對照組(P＜0.01),具有統(tǒng)計學意義。
　　 2.免疫組織化學實驗結果:①mGluR1α

9、免疫組化結果:長期D-半乳糖處理可增加mGluR1α在中腦黑質、尾殼核和海馬的表達強度。顯微鏡40倍物鏡下觀察,D-半乳糖處理組小鼠在中腦黑質和尾殼核mGluR1α陽性纖維免疫反應明顯增強。通過靜態(tài)灰度值分析發(fā)現(xiàn):D-半乳糖處理組黑質為151.50±8.26,對照組黑質為157.23±5.57;D-半乳糖處理組尾殼核為148.51±9.80,對照組尾殼核為154.35±7.70;D-半乳糖處理組海馬腔隙層為155.04±8.05,對照組

10、海馬腔隙層為158.89±7.15;D-半乳糖處理組海馬始層為154.29±6.41,對照組海馬始層為158.89±8.31,D-半乳糖處理組小鼠黑質、尾殼核和海馬腔隙層mGluR1α灰度值明顯低于對照組(P＜0.01),海馬始層mGluR1α灰度值低于對照組(P＜0.05),具有統(tǒng)計學意義。②GLT免疫組化結果:長期D-半乳糖處理可降低GLT在中腦黑質和海馬的表達強度。顯微鏡40倍物鏡下觀察,D-半乳糖處理組小鼠在中腦黑質GLT陽性纖

11、維免疫反應明顯減弱,在尾殼核無明顯變化,但較對照組稀疏。通過靜態(tài)灰度值分析發(fā)現(xiàn):D-半乳糖處理組黑質為151.06±5.94,對照組黑質為141.03±8.00;D-半乳糖處理組尾殼核為157.46±6.03,對照組尾殼核為157.37±6.14;D-半乳糖處理組海馬錐體層為153.89±7.50,對照組海馬錐體層為151.00±9.17,D-半乳糖處理組小鼠黑質GLT灰度值明顯高于對照組(P＜0.01),海馬錐體層GLT灰度值高于對照

12、組(P＜0.05),具有統(tǒng)計學意義;D-半乳糖處理組小鼠尾殼核GLT灰度值較對照組無明顯差異(P＞0.05)。
　　 結論:1.長期D-半乳糖處理可導致小鼠出現(xiàn)與自然老化類似的神經元損傷,表現(xiàn)為黑質神經元數量減少;2.長期D-半乳糖處理增加小鼠黑質、尾殼核和海馬mGluR1α的含量;3.長期D-半乳糖處理減少小鼠黑質和海馬GLT的含量;4.推測長期D-半乳糖處理可能通過擾亂谷氨酸受體功能,減少谷氨酸轉運體,改變谷氨酸代謝,增強谷