自發(fā)性癲癇大鼠海馬電壓門控性鈉通道的表達研究.pdf

1、電壓門控性鈉通道為一種跨膜的糖蛋白，其在神經(jīng)元動作電位的產(chǎn)生與傳播過程中發(fā)揮重要作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，鈉通道通常由一個α型大亞基(260KD)和一個或多個β型小亞基(32～37KD)組成，其結(jié)構(gòu)均由四個有50％序列同源的結(jié)構(gòu)域(Ⅰ～Ⅳ)組成，每個結(jié)構(gòu)域含有6個跨膜片段(S1～S6)。研究表明α型大亞基與β型小亞基均具有對鈉通道失活與激活動力學(xué)的調(diào)節(jié)作用；此外β型小亞基可以作為細胞黏附因子來發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。 自發(fā)性癲癇大鼠(Spo

2、ntaneously epileptic rat，SER)是一種純合型的雙基因突變大鼠：其突變基因tm來自于東京Wistar大鼠突變系Tremor，突變基因zi來自于德國斯普拉格——道利鼠突變系Zitter，兩種突變基因均為常染色體隱性遺傳。出生后8周，SER自發(fā)性地出現(xiàn)癲癇大發(fā)作和失神樣的小發(fā)作，其腦電圖典型表現(xiàn)為皮質(zhì)與海馬區(qū)出現(xiàn)的5～7赫茲的棘慢復(fù)合波。到目前為止，SER被認為是研究人類癲癇最好的動物模型之一，抗癲癇藥物對SER的治

3、療作用反應(yīng)與對人類癲癇作用十分相近。有報道利用SER進行有關(guān)改善天冬氨酸酰酶的基因治療；而涉及離子通道病方面，僅報道了SER電壓門控性鈣通道的功能變化。 然而，迄今為止，有關(guān)SER電壓門控鈉通道的研究仍為空白。在本研究中，我們假設(shè)SER在其遺傳性癲癇發(fā)生發(fā)展中涉及到鈉通道的參與與變化。因此，我們擬從基因與蛋白兩個層面研究SER電壓門控性鈉通道的表達情況，以期明確其在癲癇海馬興奮性中的角色與作用。 實驗材料和方法：

4、 1、材料 動物、試劑與儀器：健康SER和正常Wistar大鼠9～12周齡，每個實驗組均為6只；Wistar新生鼠5只，均小于一周齡；雌雄不限，均由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供。Trizol(GIBCO BRL)，免疫組化SP試劑盒(北京中山公司)，實時定量RT-PCR試劑盒(Takara)，引物由上海生工生物工程公司合成，其他藥物均為國產(chǎn)分析純。Ⅰ型與Ⅲ型鈉通道亞基兔多克隆抗體(anti—Nav1.1，anti—Nav1.3，S

5、igma)，anti-βlex由密歇根大學(xué)Lori L．Isom博士贈送；CM1800 LEICA冰凍切片機(德國)，PCR儀(PE—9600，PE—2400)，凝膠自動成像儀(美國，GDSH型)，MetaMor2ph/DP10/BX41圖像分析系統(tǒng)(美國)。 2、方法 RT-PCR分析：總的RNA從SER與正常Wistar大鼠整個海馬組織中提取，參照Takara試劑盒進行實時定量RT-PCR操作。目的基因Nav1.1

6、、Nav1.3和β1亞基mRNA的相對表達水平用目的基因與管家基因的平均光密度比值確定。 實時定量RT-PCR分析：總的RNA從SER與正常Wistar大鼠整個海馬組織中提取，參照Takara試劑盒進行實時定量RT-PCR操作。目的基因七點標準曲線通過反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物五倍稀釋物進行。目的基因Nav1.1、Nav1.3和β1亞基mRNA的相對表達水平用目的基因與管家基因的拷貝數(shù)比值確定。 免疫熒光分析：SER組、正常對照組與新生

7、鼠組(陽性對照)腹腔麻醉后快速取出鼠腦，常規(guī)制作冰凍切片。鈉通道亞基兔多克隆抗體一抗(anti—Nav1.1，1：25稀釋；anti-βlex，1:100稀釋；anti—Nav1.3，1：25稀釋)常溫30分鐘后4℃過夜，用FITC標記的羊抗兔二抗孵育切片，PBS漂洗三次后，熒光顯微鏡觀察。 免疫組化分析：SER組與正常組常規(guī)做石蠟切片。鈉通道亞基兔多克隆一抗(anti-βlex，1:100稀釋；anti—Nav1.1，1：25

8、稀釋)孵育切片，常溫30分鐘后4℃過夜。用針對一抗的生物素標記的羊抗兔二抗孵育切片，37℃1小時。DAB顯色后，用蘇木精做核復(fù)染。每只大鼠取10張腦片，其斷面水平各鼠均相似，所有腦片均在同一放大倍數(shù)(×400)、同一光強度下分析。首先分析海馬內(nèi)平均陽性細胞數(shù)，然后用MetaMorph/DP10/BX41圖像分析系統(tǒng)測定各組海馬CA1、CA3與齒狀回蛋白陽性反應(yīng)物的平均灰度值。 免疫印跡分析：SER組、正常對照組與新生鼠組(陽性對

9、照)腹腔麻醉后快速取出鼠海馬，提取總蛋白?？捡R斯亮藍法測蛋白濃度，上樣后進行SDS-PAGE蛋白電泳，一抗(anti-βlex，1：500稀釋；anti—Nav1.1，1：200稀釋；anti—Nav1.3，1：200稀釋)孵育。ECL與DAB顯影。 統(tǒng)計學(xué)分析：各組結(jié)果以平均值±標準差表示，兩組間比較用t檢驗。 結(jié)果： 1、RT-PCR結(jié)果顯示：SER海馬Nav1.1 mRNA的表達顯著高于正常對照組(1.14

10、±0.16 in SERs vs0.68±0.11 in control rats；p<0.001)；SER海馬Nav1.3mRNA的表達亦顯著高于正常對照組(0.89±0.17 in SERs vs0.45±0.16 in control rats；p<0.001)；同樣的，SER海馬β1亞基mRNA的表達顯著高于正常對照組(1.12±0.11 in SERs vs0.91±0.14 in control rats；p<0.05)。

11、 2、實時定量RT-PCR結(jié)果顯示：SER海馬Nav1.1 mRNA的表達顯著高于正常對照組(1.01±0.37 in SERs vs0.36±0.11 in control rats；p<0.001)；SER海馬Nav1.3 mRNA的表達亦顯著高于正常對照組(0.55±0.15 in SERs vs0.39±0.15 in control rats；p<0.001)；同樣的，SER海馬β1亞基mRNA的表達顯著高于正常對照組(

12、0.62±0.13 in SERs vs0.52±0.07 in control rats；p<0.05)。綜上，SER海馬Nav1.1、Nav1.3和β1亞基在mRNA水平表達上調(diào)。 3、免疫熒光結(jié)果顯示：Nav1.1和β1亞基蛋白在SER和正常大鼠海馬各區(qū)均有表達；Nav1.3蛋白在新生鼠(三天齡，陽性對照)海馬有表達；然而，在正常對照大鼠中未見顯著表達Nav1.3蛋白的陽性細胞；值得注意的是，正常對照大鼠微量表達的Nav1

13、.3蛋白在SER海馬有顯著的陽性表達。 4、免疫組化結(jié)果證實：Nav1.1和β1亞基蛋白免疫反應(yīng)性的陽性細胞在SER和正常大鼠海馬各區(qū)均有表達，包括CA1、CA3以及齒狀回顆粒細胞區(qū)；SER海馬各區(qū)Nav1.1和β1亞基蛋白免疫反應(yīng)性的陽性細胞數(shù)和平均灰度值均顯著高于正常對照大鼠，提示SER海馬各區(qū)Nav1.1和β1亞基蛋白表達上調(diào)。 5、免疫印跡結(jié)果進一步證實：SER海馬Nav1.1蛋白表達顯著高于正常對照組(0.52

14、±0.05 in SERs vs0.30±0.04 in control rats： p<0.001)；SER海馬Nav1.3蛋白表達亦顯著高于正常對照組(0.38±0.07 in SERs vs0.17±0.05 in control rats；p<0.001)；然而，SER海馬Nav1.3蛋白表達與新生鼠陽性對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(0.38±0.07 in SERs vs0.37±0.05 in neonatal rats；p>0.05

15、)；SER海馬β1亞基蛋白的表達亦顯著高于正常對照組(0.40±0.06 in SERs vs0.29±0，05 in control rats；p<0.05)。綜上，SER海馬Nav1.1、Nav1.3和β1亞基在蛋白水平表達上調(diào)。 結(jié)論： 1、首次證實，與正常Wistar大鼠比較，SER海馬Nav1.1、Nav1.3和β1亞基在mRNA水平表達上調(diào)。 2、首次發(fā)現(xiàn)，Nav1.1和β1蛋白在SER海馬各區(qū)均有表

16、達，包括CA1、CA3以及齒狀回顆粒細胞區(qū)。 3、首次證實，與正常Wistar大鼠比較，SER海馬Nav1.1和β1亞基在蛋白水平表達上調(diào)。 4、首次發(fā)現(xiàn)，正常成熟的Wistar大鼠微量表達的Nav1.3蛋白在成熟的SER海馬有顯著的陽性表達。 5、SER海馬Nav1.1、Nav1.3和β1亞基在mRNA與蛋白水平表達上調(diào)，可能會促進癲癇樣興奮活動的產(chǎn)生，進而構(gòu)成SER癲癇表型的發(fā)作基礎(chǔ)。 6、SER作為