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文檔簡介
1、本文檢測了大鼠脊髓來源神經(jīng)干細(xì)胞NgR的表達(dá)情況,在體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中加入Nogo-66的活性片段Nogo-P4,顯微測量神經(jīng)元神經(jīng)突長度,觀察Nogo-66對神經(jīng)干細(xì)胞分化形成的神經(jīng)元神經(jīng)突生長是否同樣存在抑制作用,并進(jìn)一步觀察能否用RNAi的方法沉默神經(jīng)干細(xì)胞NgR基因表達(dá),阻斷Nogo-66的抑制作用。 實(shí)驗(yàn)方法: 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 生后24h內(nèi)的Wistar大鼠由中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。
2、 二、主要試劑 表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、NgR和nestin兔抗鼠單克隆抗體購自Chemicon公司,堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basal fibroblast growth factor,bFGF)、DMEM/F12培養(yǎng)基、B27、PI、Alexa Fluor 488羊抗兔熒光二抗、Block-ItFluorescent Oligo、Lipofectamine 2000和Opt
3、i MEM I均購自Invitrogen公司。兔抗鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白質(zhì)(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和髓鞘堿性蛋(myelin basic protein,MBP)抗體均購自武漢博士德生物公司。Nogo-P4購自ADI公司。 三、神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定。 (一)細(xì)胞培養(yǎng)。取4只出生24h內(nèi)的Wis
4、tar大鼠,處死后在超凈臺內(nèi)取出脊髓。將脊髓剪碎,胰酶消化后加入添加有B27、20ng/ml bFGF和20ng/ml EGF的DMEM-F12培養(yǎng)基,重懸浮,200目細(xì)胞篩過濾后接種于培養(yǎng)瓶中,置于37~C 5%CO<,2>培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。 (二)Nestin免疫熒光染色。培養(yǎng)2周后,取神經(jīng)球固定后,以nestin兔抗鼠單克隆抗體標(biāo)記,常規(guī)方法免疫熒光染色,熒光顯微鏡下觀察照相。 (三)誘導(dǎo)分化。取神經(jīng)球盡量吹打分散
5、成單細(xì)胞,將神經(jīng)干細(xì)胞懸液加入預(yù)先已置入玻璃蓋片的6孔培養(yǎng)板中,加入10%胎牛血清。1周后取出蓋片,分別以NSE,GFAP和MBP抗體標(biāo)記,常規(guī)方法免疫熒光染色。 四、NgR表達(dá)的檢測。培養(yǎng)2周后,取神經(jīng)球固定后,以NgR兔抗鼠單克隆抗體標(biāo)記,常規(guī)方法免疫熒光染色,熒光顯微鏡下觀察照相。 五、小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)的設(shè)計(jì)和合成。利用Invitrogen公司網(wǎng)上siRNA
6、設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)3條大鼠NgR mRNA的siRNA,由Invitrogen公司進(jìn)行合成相應(yīng)的雙鏈RNA(double stranded RNA,dsRNA)。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)篩選出阻斷NgR基因最有效的一條siRNA,其序列為:Sequence(5’to 3’):-UGC AGU ACC UCU ACC UAC AAG ACA ASequence(5’to 3’):-UUG UCU UGU AGG UAG AGG UAC UGC A。 六
7、、實(shí)驗(yàn)分組。將神經(jīng)干細(xì)胞分為siRNA組,Nogo-P4組,siRNA+Nogo-P4組和對照組。對照組加入10%胎牛血清使神經(jīng)干細(xì)胞開始分化;Nogo-P4組加入10%胎牛血清和4μmol/1的Nogo-P4:siRNA組的神經(jīng)干細(xì)胞先經(jīng)過siRNA轉(zhuǎn)染,24h后加入10%胎牛血清開始分化;siRNA+Nogo-P4組的神經(jīng)干細(xì)胞先經(jīng)過siRNA轉(zhuǎn)染,24h后加入10%胎牛血清和4μmol/1的Nogo-P4開始分化。 七、s
8、 i RNA的轉(zhuǎn)染。取1ml含神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)液加入離心管,800r/min離心5min,棄上清,加入900ul不含抗生素的培養(yǎng)基,機(jī)械吹打分散細(xì)胞,加入siRNA和轉(zhuǎn)染試劑的混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染。24h和72h后檢測NgR基因表達(dá)。另取部分神經(jīng)干細(xì)胞以熒光標(biāo)記的dsRNA(Block-It Fluorescent Oligo)進(jìn)行相同條件下的轉(zhuǎn)染,熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。 八、NgR基因沉默效率的檢測。 (一)免疫熒
9、光檢測轉(zhuǎn)染24h和72h后的神經(jīng)干細(xì)胞固定后,加入NgR兔抗鼠單克隆抗體標(biāo)記,常規(guī)方法免疫熒光染色,熒光顯微鏡下觀察照相。每張蓋片隨機(jī)取10個(gè)視野,計(jì)數(shù)NgR陽性細(xì)胞數(shù)N和總細(xì)胞數(shù)T,計(jì)算阻斷效率(T-N)/T。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 (二)Western blot檢測將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中,1000rpm離心5min。棄上清,加入4mlPBS并輕輕吹打洗滌,然后1000rpm離心5min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。棄去上清,
10、加400μl裂解液,冰上裂解30min。將裂解液4℃、12000rpm離心5min,取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。蛋白上樣量30μg,上樣前將樣品于沸水中煮5min。電泳后轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜。5%的脫脂牛奶封閉非特異性背景,室溫1h。將兔抗鼠NgR抗體用TBST稀釋至1∶400,將膜放入一抗稀釋液中,4℃過夜。用TBS在室溫下洗兩次,每次10min;再用TBS洗一次,10min。準(zhǔn)
11、備二抗稀釋液并與膜接觸,室溫下孵育2h。用TBS在室溫洗兩次,每次10min;再用TBS洗一次,10min。用KPL公司的蛋白檢測試劑盒顯色。 九、神經(jīng)元神經(jīng)突長度的測量。神經(jīng)干細(xì)胞分化第3d,以NSE抗體標(biāo)記,常規(guī)方法免疫熒光染色,熒光顯微鏡下觀察照相。使用Image-Pro Plus 5.0軟件進(jìn)行神經(jīng)元細(xì)胞神經(jīng)突長度的測量。 十、統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS11.5軟件進(jìn)行處理,差異顯著性采用單因素方差分析
12、。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞形成典型的神經(jīng)球,經(jīng)免疫熒光檢測nestin和NgR表達(dá)陽性。加入10%胎牛血清分化1周后,可觀察到NSE,GFAP和MBP標(biāo)記陽性的細(xì)胞。這表明培養(yǎng)出的神經(jīng)球具備分化成神經(jīng)元,星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力,是神經(jīng)干細(xì)胞。 NgR抗體標(biāo)記染色后,分化前的神經(jīng)球和散在的單細(xì)胞均呈現(xiàn)強(qiáng)表達(dá)。 分化第3d,NgR表達(dá)陽性的細(xì)胞比率明顯下降,只有(35.3±4.31)%的細(xì)胞NgR
13、表達(dá)陽性。分化細(xì)胞的形態(tài)趨于成熟,可以識別出部分具有典型形態(tài)的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。經(jīng)雙重免疫熒光染色證實(shí),NgR表達(dá)陽性的細(xì)胞均為NSE表達(dá)陽性的細(xì)胞,多數(shù)NgR<'+>/NSE<'+>的細(xì)胞具有典型的神經(jīng)元形態(tài),雙極或多級,有較長的突起。 分化第3d Nogo-P4組神經(jīng)元神經(jīng)突長度為80.54±6.75μm;對照組神經(jīng)元神經(jīng)突長度為97.80±6.971μm。Nogo-P4組和對照組神經(jīng)元神經(jīng)突長度有顯著差異,P<0.01。N
14、ogo-P4組神經(jīng)元神經(jīng)突長度較對照組縮短約17%。 siRNA組神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染后大部分神經(jīng)干細(xì)胞存活,少量細(xì)胞死亡,存活的細(xì)胞活力良好,超過24h后不再出現(xiàn)細(xì)胞死亡。部分神經(jīng)干細(xì)胞以熒光標(biāo)記的dsRNA(Block-It Fluorescent Oligo)進(jìn)行相同條件下的轉(zhuǎn)染,在熒光顯微鏡下觀察證實(shí)dsRNA已進(jìn)入神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi),轉(zhuǎn)染獲得成功,轉(zhuǎn)染效率為94.3%。 轉(zhuǎn)染后24h神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)NgR抗體標(biāo)記染
15、色,熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)大量神經(jīng)干細(xì)胞的NgR表達(dá)陰性,這表明RNA干擾可以引起NgR基因表達(dá)沉默。用隨機(jī)打亂順序的siRNA轉(zhuǎn)染作為陰性對照,神經(jīng)干細(xì)胞的NgR表達(dá)沒有減弱,鏡下顯示為明亮的綠色熒光。Western blot檢測的結(jié)果證實(shí)對照組和經(jīng)隨機(jī)打亂順序的siRNA(scrambled siRNA)轉(zhuǎn)染后24小時(shí)的神經(jīng)干細(xì)胞NgR均顯著表達(dá),經(jīng)siRNAC轉(zhuǎn)染后24 h的神經(jīng)干細(xì)胞NgR表達(dá)顯著降低。轉(zhuǎn)染后24h的NgR基因阻斷
16、效率為(90.35±3.1)%。轉(zhuǎn)染后72h的NgR基因阻斷效率為(89.96±3.9)%。 分化第3d,siRNA組神經(jīng)元神經(jīng)突長度為92.14±7.27μm,siRNA+Nogo-P4組神經(jīng)元神經(jīng)突長度為94.01±8.37μm。siRNA組及siRNA+Nogo-P4組和對照組神經(jīng)元神經(jīng)突長度無顯著差異:siRNA+Nogo-P4組和Nogo-P4組神經(jīng)元神經(jīng)突長度有顯著差異,P(0.01。 研究結(jié)論: 1
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