FK506及神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)異體神經(jīng)移植作用的研究.pdf

1、第一部分：大鼠胚胎腦組織神經(jīng)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定 目的:體外無血清條件下分離、培養(yǎng)胚鼠神經(jīng)干細(xì)胞，觀察其生長(zhǎng)及分化情況，為進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植創(chuàng)造基礎(chǔ)。 方法：通過采用機(jī)械分離和消化分離相結(jié)合的方法，取孕14～16dSD系大鼠的胚胎海馬組織，在含EGF、bFGF和B27的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)、傳代，進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)，顯微鏡下觀察其增殖分化過程，并對(duì)原代和傳代培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行Nestin免疫熒光染色，鑒

2、定是否為神經(jīng)干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后應(yīng)用NSE及GFAP抗體進(jìn)行鑒定。 結(jié)果：鼠腦組織中成功培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞，在無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞不斷分裂增殖，8d左右就可以形成胞體透亮、折光性好的干細(xì)胞球，細(xì)胞免疫熒光染色證實(shí)細(xì)胞系巢蛋白陽性，并能在體外傳代培養(yǎng)和連續(xù)形成克??；經(jīng)血清培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化后部分呈NSE陽性，部分呈GFAP陽性?？寺〉恼T導(dǎo)及分化實(shí)驗(yàn)表明，克隆具有多分化能力，神經(jīng)元標(biāo)志物NSE、星性膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物GFAP的檢測(cè)結(jié)果

3、均呈陽性。 結(jié)論：分離和培養(yǎng)的細(xì)胞能表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物巢蛋白，并且具有很強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能，說明新生大鼠海馬存在神經(jīng)干細(xì)胞，并可進(jìn)一步用于神經(jīng)干細(xì)胞移植治療疾病的研究。 第二部分： FK506及神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)異體神經(jīng)移植生長(zhǎng)的作用 目的：探討FK506及神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)異體神經(jīng)移植生長(zhǎng)的影響。 方法：共使用50只大鼠，其中Brown-Norway（BN）大鼠10只，作為神經(jīng)移植的供體；Lewi

4、s（L）大白鼠40只，隨機(jī)分成四組，每組10只，左側(cè)坐骨神經(jīng)切斷后，造成1cm缺損，采用Brown-Norway大鼠坐骨神經(jīng)1cm移植修復(fù)；A組未施加干預(yù)因素，B組植入神經(jīng)干細(xì)胞，D組注射FK506，C組同時(shí)應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞及注射FK506（神經(jīng)干細(xì)胞預(yù)先用BrdU標(biāo)記）。術(shù)后12周，行后肢運(yùn)動(dòng)及感覺評(píng)估，進(jìn)行肌電圖檢查神經(jīng)傳導(dǎo)情況；取下組織后進(jìn)行坐骨神經(jīng)組織學(xué)檢查、腓腸肌濕重測(cè)定，并采用抗體GFAP、BrdU進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢查，觀察在

5、蛋白水平變化，后進(jìn)行NGF及GAP-43的原位雜交檢查，在mRNA水平檢測(cè)干預(yù)因素對(duì)異體神經(jīng)移植的作用。 結(jié)果：同時(shí)接受神經(jīng)干細(xì)胞及注射FK506組，其短期內(nèi)出現(xiàn)體重恢復(fù)慢、進(jìn)食差及少動(dòng)，但6周后腓腸肌濕重優(yōu)于其他組，坐骨神經(jīng)肌電圖檢查及組織形態(tài)恢復(fù)優(yōu)于單獨(dú)接受神經(jīng)干細(xì)胞或FK506組及對(duì)照組；免疫組化結(jié)果顯示：同時(shí)接受神經(jīng)干細(xì)胞及注射FK506組GFAP及BrdU表達(dá)高于其他組，移植干細(xì)胞組顯示BrdU高表達(dá)，原位雜交結(jié)果顯示