神經(jīng)干細胞研究進展

1、,神經(jīng)干細胞研究進展,,,,,報告內(nèi)容提要國內(nèi)外研究現(xiàn)狀骨髓源神經(jīng)干細胞的橫向分化骨髓源神經(jīng)干細胞致瘤性研究骨髓源神經(jīng)干細胞的活體示蹤,,,,,,,,一、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀,神經(jīng)干細胞的概念,神經(jīng)干細胞是指來源于神經(jīng)組織及神經(jīng)組織的發(fā)源地、終生保持自我更新能力，并能分化為各種神經(jīng)組織細胞的一類細胞稱為神經(jīng)干細胞。,神經(jīng)干細胞的研究概述,1989，Tamir等由造血干細胞引申出神經(jīng)干細胞的概念 Reynolds BA（1992 S

2、cience）正式提出神經(jīng)干細胞的概念 90年代以后，國內(nèi)外興起了神經(jīng)干細胞的研究熱潮,,,,神經(jīng)干細胞的來源,胚胎源性神經(jīng)干細胞 （早期胚胎 胚胎神經(jīng)組織） 成體源性神經(jīng)干細胞 神經(jīng)組織 非神經(jīng)組織（骨髓、脂肪、皮膚等）,,,,神經(jīng)干細胞種子細胞來源,,妊娠3個月,1.胚胎,,,終止妊娠，取胎腦,分離獲取神經(jīng)干細胞,孵化培養(yǎng),移植,,,,,,存在的問題①倫理②免疫排斥③細胞數(shù)量少,,,2.克隆,卵細

3、胞,卵細胞吸除核+精細胞DNA,電或化學刺激,形成胚胎妊娠3個月,終止妊娠,取胎腦獲取干細胞,移植,,,,,,,存在問題,,存在的問題①倫理問題②基因缺失 或突變,,3.自身成體干細胞,骨髓（室管膜、脂肪）,誘導分化傳代增殖,神經(jīng)干細胞,移 植,,,,,優(yōu) 點①骨髓來源豐富、獲 取容易②不存在倫理問題③不存在免疫排斥問題 困 難 定向誘導分化難度大,,4.髓鞘移植,獲取胚胎嗅鞘細胞,培

4、養(yǎng)傳代增殖,髓鞘細胞,移 植,,,,,存在問題①僅適用脫髓鞘疾病②倫理問題③免疫排斥④細胞數(shù)量少,,,二、骨髓源神經(jīng)干細胞的橫向分化,,,,雌性SD大鼠,,,,,,,,,,,,,,,,,,陰道脫落細胞涂片 排卵期,,,,,,,,,,,,,,,合籠,,,,,,,,三種實驗材料,,,0.5天胚鼠（精子+）,,,,10.5-14.5日胚鼠（作對照）,,,,大鼠、貓、家犬骨髓,雄性大鼠,,骨髓穿刺,,恒河猴 /

5、成人骨髓,（1）,（2）,（3）,,,,,,,主要移植過程,,,動物神經(jīng)干細胞BrdU或GPF標記）,動物/人神經(jīng)干細胞,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,離心，細胞懸浮于 0.85% 生理鹽水中,經(jīng)立體定向或靜脈或腦室注射，移植到模型動物或病員體內(nèi),,觀察動物切片人PET等,,a,b,,,,,a 原代培養(yǎng)24h。 Nestin 陽性的細胞克隆形成（箭頭） b 傳代培養(yǎng)48h。 細胞再次形成克隆（箭頭

6、）,,,,,a,b,a 形成的神經(jīng)干細胞克隆球b 有神經(jīng)元/神經(jīng)膠質(zhì)細胞樣長突起細胞分化,,,圖1. 在蘇木素預染背景下由神經(jīng)球傳代培養(yǎng)后的Nestin陽性細胞（↑）。而已分化的細胞則呈Nestin陽性（▲）(400X) 圖2. 在有血清條件下傳代培養(yǎng)3周的NSE陽性細胞 (400X) 圖3. 在有血清條件下傳代培養(yǎng)3周的GFAP陽性細胞 (400X) 圖4. 在無血清傳代培養(yǎng)中的Nestin陽性神經(jīng)球(400X),,,,

7、,,,,,NESTIN免疫磁珠法分離大鼠神經(jīng)干細胞（箭頭）,,,丫啶橙熒光染色鑒定大鼠神經(jīng)干細胞及分化細胞活力情況（a,b）.NESTIN免疫磁珠標記的大鼠神經(jīng)干細胞（c）。,a,b,c,,,NSCs提純后流式細胞儀檢測結(jié)果。a 同型對照；b 陽性Result of flow cytometry at post-purification . a Immunomagnetic beads-free; b With immunoma

8、gnetic beads,,大鼠NSCs提純后檢測神經(jīng)干細胞BF-1(腦因子) 、部分分化早期細胞 GABA（?氨基丁酸）和TH（酪氨酸羥化酶）總RNA表達,7 6 5 M 4 3 2 1,880 bp 600 bp 460 bp 350 bp100 bp,THGABABF-1,,大鼠NSCs提純后RT-PCR法鑒定神經(jīng)干細胞不同蛋白表達。

9、 1:BF-1 ；2:TH ；3:GABA ； M：分子量標記； Control:PBS對照,7 6 5 M 4 3 2 1,M 1 2 Control,100 bp350 bp460 bp520bp600 bp880 bp,,,,,,,,,,,3,,a,b,,,,,,,,c,d,大鼠骨髓基質(zhì)細胞。0h（a）；13h（b

10、）；39.5h（c）. 培養(yǎng)70h（d），將細胞球分離成單細胞再種植于滋養(yǎng)細胞層（空箭頭），有典型的神經(jīng)元樣長突起細胞形成（黑箭頭）。,,,大鼠骨髓基質(zhì)細胞。 a 細胞增殖情況 (48h, 100×) b 細胞分化情況（17d, 200×） c 分化細胞形態(tài)（24d, 400×）,a,b,c,,貓骨髓基質(zhì)細胞。9天（a，×400）；18天（b，

11、×400 ）; 1周（c ， ×400 ）；4周(d ， ×100 )源于骨髓的神經(jīng)干細胞發(fā)育成大圓細胞，并可見到處于分裂中及分化后的細胞。,a,b,,,,c,d,,家犬骨髓源性神經(jīng)干細胞分化而來典型的神經(jīng)元樣細胞。（ × 400 ）,,家犬骨髓源性神經(jīng)干細胞。擴增72h，克隆形成（ × 200）,,,恒河猴的捕捉、麻醉、骨髓獲取。,,,,恒河猴骨髓源性NSCs。 a 純化后M

12、SCs光鏡下 形態(tài)（1d, 200 ×）b 增殖后形成的島嶼狀細胞團（7d, 200×）c 分化后細胞光鏡下的形態(tài)（24d，100×）,a,b,c,,a,b,c,d,恒河猴骨髓源性神經(jīng)干細胞分化為典型的神經(jīng)元樣細胞,,,恒河猴骨髓源性NSCs。 a Nestin染色 （10天，DAB顯色，200×） b 分化后表達NSE抗原陽性的細胞 （ 20天， DAB顯色，

13、200×） c 分化后表達GFAP抗原陽性的細胞 （ 18天，DAB 顯色，200×）,a,b,c,,a 手術(shù)切口 b MPTP緩慢注入頸內(nèi)動脈,a,b,,,模型制作后５w, PET（放射顯影劑為1- [18F] 氟代- 2-脫氧葡萄糖, 2-[18F]FDG）檢查結(jié)果.上圖為軸位，下圖為冠狀位，每圖左側(cè)為模型側(cè)，右側(cè)為對照側(cè)，可見模型側(cè)基底節(jié)區(qū)放射性濃聚明顯少于對

14、照側(cè),模型動物代謝改變（PET檢查）,,,PET檢查模型動物代謝改變（a,b 冠狀切；c,d 水平切）,,a 造模后10w, 對模型動物進行灌注． bcd：恒河猴大腦． e：恒河猴腦干,a,b,c,d,e,再固定后冰凍切片,,,雙側(cè)黑質(zhì)中線兩側(cè)DAB染色對比. 左圖為正常側(cè)，右圖為模型側(cè)（造模后10w, 40×),,,對照側(cè) 模型側(cè)　　　中腦切片DAB染色顯示雙側(cè)紅核（造模后10w, 4

15、0×）,,,a 恒河猴中腦切片對照側(cè)黑質(zhì)TH染色, 改良SABC法 （造模后10w, 200×,）b 恒河猴PD模型側(cè)TH染色，改良SABC法 　　（造模后10w, 200×）,a,b,,,T7,,P CMV CMV,,,BGH PA,ITR,,Amp,r,,,pol

16、yA,,CoiE1,,SV40,,ITR,,SV40AP,,Neomycin,SP6,,,,EcoR I EcoR I,,CMV,,ITR,,polyA,,Amp,r,,ITR,Construction of pWAV2-TH,,,pcDNA3,-TH,,pWAV2,,,,,,,,,,Kpn I,EcoR I,Sma I,Sal I,Bgl II,,,,,,,,,,,,,Hind

17、 III,Kpn I,BamH I,BstX I,TH,EcoR I,EcoR V,BstX I,Not I,Xho I,Xba I,Apa I,,f1ori,,,,,,,pWAV2,-TH,,,,,,,,,,Kpn I,TH,,EcoR I,Sma I,Sal I,Bgl II,,,Amp,r,TH基因載體構(gòu)建,,轉(zhuǎn)TH基因免疫細胞化學檢測（為NSC轉(zhuǎn)基因移植治療奠定基礎）,,體外Brdu標記陽性的恒河猴骨髓源性神經(jīng)干細胞(10d,

18、 200×),,源于人骨髓基質(zhì)細胞的神經(jīng)干細胞，移植前以rAAV-GFP 標記的細胞狀態(tài),a,b,c,d,e,f,,,,假傷組14×24h腦片(未見BrdU+細胞, × 400),模型常規(guī)治療組14×24h 腦片(偶見BrdU+細胞, × 400),關于移植后NSC 出現(xiàn)時間的初步探索（家犬）,,,干細胞經(jīng)腦室治療組：傷后第14×24h傷區(qū)BrdU+細胞，× 40

19、0,干細胞經(jīng)血管內(nèi)治療組：傷后第14×24h中腦傷區(qū)BrdU+細胞, × 400,家犬骨髓源性神經(jīng)干細胞經(jīng)BrdU+標記后移植至損傷腦內(nèi)（×400 ） 關于NSC移植途徑的初步探索（家犬）,,人骨髓源性神經(jīng)干細胞。陳某，男，38歲. 神經(jīng)干細胞克隆球形成，并有長突起細胞分化。,a: 0h b: 7d c:10d d:12d,a,b,c,d,,,,

20、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,人骨髓源性神經(jīng)干細胞增殖分裂情況（１）,,人骨髓源性神經(jīng)干細胞增殖分裂情況（２）,,a,b,c,d,人骨髓源性神經(jīng)干細胞。李某，男，45歲.由源于骨髓基質(zhì)細胞的神經(jīng)干細胞球分化出神經(jīng)元樣長突起細胞。 14d （a、b），17d（c、d）.,,a,b,人骨髓源性神經(jīng)干細胞。何某，女性，22歲. 源于骨髓基質(zhì)細胞的神經(jīng)干細胞克隆球及其分化的神經(jīng)元樣長突起細胞。原代培養(yǎng)12d（a ） ，

21、18d（b ）。,,人骨髓源性神經(jīng)干細胞。張某，女，42歲d. 骨髓基質(zhì)細胞 原代培養(yǎng) 8 天（a,b），細胞發(fā)育更大、更圓，顆粒明顯。培養(yǎng) 10天d (c,d)，具有長突起的神經(jīng)元樣細胞分化形成，突起間有連接。,a,b,c,d,,a,b,c,人骨髓源性神經(jīng)干細胞。朱某，男，27歲。分化前的干細胞階段（a, 12天）及分化后形成典型的神經(jīng)元樣長突起細胞(b，20-30天 )。,,a,b,源于人骨髓神經(jīng)干細胞的長突起細胞免疫細胞化學方

22、法鑒定。 a NSE陽性. 雙極神經(jīng)元.b GFAP-陽性，神經(jīng)膠質(zhì)細胞。.,,,氨基酸標準品混合液4.183: 天冬氨酸；7.947: 谷氨酸；11.661:甘氨酸,RA因子培養(yǎng)10天純骨髓源性神經(jīng)干細胞,,天冬氨酸,氨基酸標準品混合液4.183: 天冬氨酸；7.947: 谷氨酸；11.661:甘氨酸,Lif因子培養(yǎng)10天純骨髓源性神經(jīng)干細胞,,谷氨酸,純培養(yǎng)基空白對照,肝臟細胞陰性對照,,,,源于人骨髓基質(zhì)細胞的神經(jīng)

23、干細胞，移植前狀態(tài)。,a,b,c,d,,,,,,,,,,,,20%,30%,40%,10%,,,骨髓源性神經(jīng)干細胞移植手術(shù)中。(神經(jīng)干細胞準備),,,手術(shù)顯微鏡檢測下進行神經(jīng)干細胞移植。,,傷后３個月運動性失語神經(jīng)干細胞移植術(shù),術(shù)前,術(shù)后（6個月）,術(shù)前,術(shù)后（4個月）,C3-6損傷3個月病員，神經(jīng)干細胞移植術(shù),三、骨髓源神經(jīng)干細胞致瘤性研究,U251細胞豆球蛋白A（ConA）凝集試驗（ConA:100μg/ml），顯示U251腫瘤細

24、胞有明顯的凝集反應，細胞表面結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。光鏡100×,骨髓源性NSC豆球蛋白A（ConA）凝集試驗（ConA:100μg/ml），顯示骨髓源性NSC無明顯的凝集反應。光鏡200×,神經(jīng)干細胞的致瘤性研究,體外培養(yǎng)10天的骨髓源性NSC的染色體Ｇ帶核型分析，顯示為正常核型（46，XY），未見染色體數(shù)目異常和畸變。表明經(jīng)體外培養(yǎng)的骨髓源性NSC保持了正常的遺傳學特性。,U251細胞在軟瓊脂中培養(yǎng)18天，可見明顯的細胞克

25、隆形成，表明其不具有停泊依賴性，呈現(xiàn)惡性細胞的表現(xiàn)。光鏡200×,體外培養(yǎng)的骨髓源性NSCs在軟瓊脂中培養(yǎng)18天，未見細胞克隆形成，表明其具有停泊依賴性，為正常細胞的特征。光鏡400×,U251細胞接種裸鼠兩個月，于接種部位可見明顯的腫瘤組織形成,骨髓源性NSCs接種裸鼠四個月后，接種部位未見有異常組織形成，表明體外培養(yǎng)的骨髓源性NSCs不具有體內(nèi)成瘤性。,四、骨髓源神經(jīng)干細胞的活體示蹤,圖1 光鏡下顯示菲立磁（Fe

26、ridex）標記后的大鼠骨髓源性神經(jīng)干細胞（培養(yǎng)1周）的典型Prussian Blue染色（可見細胞漿內(nèi)許多細小的藍色鐵顆粒）,圖2 光鏡下顯示Feridex標記后的大鼠骨髓源性神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞（↑）后的Prussian Blue染色（培養(yǎng)1月）,神經(jīng)干細胞的標記示蹤,激光共聚焦顯微鏡圖片顯示Feridex標記的大鼠骨髓源性神經(jīng)干細胞（培養(yǎng)1周）圖A Feridex單重標記的骨髓源性神經(jīng)干細胞（Dragon Green

27、顯示）圖B Nestin陽性的骨髓源性神經(jīng)干細胞（Texas Red顯示）圖C Feridex和Nestin雙重陽性的骨髓源性神經(jīng)干細胞（黃色）,電鏡下顯示培養(yǎng)1周后的Feridex標記大鼠骨髓源性神經(jīng)干細胞[可見細胞漿內(nèi)許多含鐵包涵體出現(xiàn)(箭頭),大鼠在進行MRI掃描,大鼠MRI掃描結(jié)果,,,,,箭頭顯示Feridex標記干細胞定位位置,大鼠MRI掃描結(jié)果,,,,,箭頭顯示Feridex標記干細胞定位位置,,神經(jīng)干細胞研究