MARK2通過調(diào)節(jié)微管相關(guān)蛋白介導Nogo-66抑制軸突生長.pdf

1、目的：
　　Nogo-66抑制軸突生長的機制至今仍不完全清楚，關(guān)于MARK2（微管親和力調(diào)節(jié)激酶2）在神經(jīng)軸突生長中的作用研究也較少報道，MARK2是否參與Nogo-66抑制軸突生長尚未有研究報道。本實驗旨在研究MARK2在Nogo-66抑制神經(jīng)元軸突生長中的作用以及MARK2對軸突生長的作用機制，并且在脊髓損傷動物模型體內(nèi)探討MARK2基因?qū)Υ笫筝S突再生的影響，為治療脊髓損傷阻斷髓鞘抑制提供一種最佳途徑。
　　方法：

2、>　　1.從Genbank中篩選MARK2基因，構(gòu)建干擾MARK2表達的shRNA質(zhì)粒和過表達MARK2的質(zhì)粒。進行腺相關(guān)病毒包裝，構(gòu)建過表達 MARK2及干擾MARK2表達的腺病毒重組體，并進行基因測序驗證。
　　2.傳代培養(yǎng)N2a細胞，在5組細胞培養(yǎng)基中加入Nogo-66，保持15min、30min、6h、24h、48h的培養(yǎng)時間后，提取蛋白，利用western-blot法檢測MARK2及p-Ser212(MARK2在Ser2

3、12位點磷酸化)蛋白表達量的變化。
　　3. N2a細胞分別感染兩種不同的腺相關(guān)病毒MARK2-AAV、shRNA MARK2-AAV后，應(yīng)用western-blot和免疫熒光法對MARK2-AAV、shRNA MARK2-AAV的表達效果進行鑒定。
　　4. N2a細胞感染MARK2-AAV、shRNA MARK2-AAV后，應(yīng)用western-blot檢測MARK2對于微管相關(guān)蛋白tau、p-S262 tau和MAP1-

4、b表達量的影響。
　　5.體外原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元細胞，根據(jù)轉(zhuǎn)染病毒的不同（EGFP-AAV或MARK2-AAV）及培養(yǎng)基有無 Nogo-66（DMSO），將神經(jīng)元分為4組：HK+DMSO,OE+DMSO,HK+Nogo-66,OE+Nogo-66。應(yīng)用免疫熒光顯微鏡拍照、測量每組神經(jīng)元軸突長度，進行統(tǒng)計學分析。
　　6.通過感染MARK2-AAV，在N2a細胞中過表達MARK2,應(yīng)用western-blot和免疫熒光法檢

5、測N2a細胞內(nèi)酪氨酸化和乙?；?微管蛋白的表達量變化。
　　7.采用24只成年雌性 SD大鼠脊髓全橫斷法建立大鼠脊髓損傷模型；根據(jù)脊髓損傷后處死時間的不同，分為6組：Control、SCI1d、SCI3d、SCI7d、SCI14d、SCI21d（每組4只），取出損傷區(qū)脊髓（正常對照組T8段脊髓），應(yīng)用western-blot檢測MARK2及p-Ser212表達量變化情況。
　　8.取16只成年雌性 SD大鼠，4只為正常對照

6、，12只建立脊髓損傷模型；建模7天后根據(jù)感覺運動區(qū)皮層注射介質(zhì)（Saline、EGFP-AAV、MARK2-AAV）的不同，隨機分為3組：Saline、EGFP-AAV、MARK2-AAV（各4只）；建模14天后，在16只大鼠皮層相同位置注射BDA（神經(jīng)示蹤劑）。建模21天后處死所有大鼠,灌注甲醛。正常組取腦及脊髓，免疫熒光顯微鏡檢測BDA標記的軸突在腦及脊髓中的走行；建模組取損傷區(qū)脊髓，應(yīng)用免疫熒光顯微鏡檢測BDA，了解軸突再生情況。

7、
　　9.實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析并以means±SEMs表示，兩組間的比較采用配對t檢驗，兩組以上使用單因素方差分析（one way ANOVA或two way ANOVA）；由于檢測目的及檢測對象的不同，采用不同的方差后分析（Dunn’s posttests，Turkey posttests，Bonferroni posttest）；P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1．干擾MARK2和過表達MAR

8、K2的腺病毒重組體經(jīng)酶切鑒定、測序，證明設(shè)計序列與設(shè)計的目的基因相符，構(gòu)建腺病毒重組體成功。
　　2．在加入Nogo-66不同時間后，總MARK2含量及MARK2在Ser212位點磷酸化程度發(fā)生了顯著下降，方差后分析結(jié)果顯示在24h和48h兩個時間點MARK2及p-Ser212均顯著降低（與對照組比較，P<0.05)。
　　3．免疫熒光和western-blot檢測結(jié)果顯示，MARK2-AAV能夠顯著提高MARK2表達量（與

9、對照組相比，P<0.05)，shRNA MARK2-AAV能夠顯著降低MARK2蛋白表達量（與對照組相比，P<0.05)。
　　4.通過過表達MARK2或干擾MARK2表達，western-blot結(jié)果顯示MARK2顯著影響tau、p-S262 tau和MAP1-b的表達，呈明顯正相關(guān)關(guān)系（P<0.05)。
　　5.體外原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元細胞在對照組中（HK+DMSO組）軸突長度為68.4±12.3μm，加入Nogo-66（

10、HK+Nogo-66組）后，軸突長度顯著下降，為28.4±6.3μm(與對照組HK+DMSO組比較，P<0.05)；過表達MARK2（OE+DMSO組）后軸突長度顯著增長，為117.4±22.6μm（與HK+DMSO組比較，P<0.05)；而經(jīng)過MARK2-AAV預處理的神經(jīng)元加入Nogo-66后（OE+Nogo-66組），能夠明顯減弱Nogo-66對軸突的抑制作用，軸突長度為66.8±9.4μm（與HK+Nogo-66組比較，P<0.

11、05)。
　　6.過表達MARK2后檢測酪氨酸化α-微管蛋白和乙?；?微管蛋白，結(jié)果顯示MARK2-AAV顯著提高酪氨酸化的α-微管蛋白水平(P<0.05)，乙?；?微管蛋白無明顯變化。
　　7.在脊髓損傷后的不同時間取損傷區(qū)脊髓后，MARK2及p-Ser212蛋白表達水平在脊髓損傷區(qū)顯著降低(與正常對照組比較，P<0.05)，證明脊髓損傷影響MARK2的表達及其磷酸化程度。
　　8.腦和脊髓矢狀位切片結(jié)果顯示，B

12、DA被神經(jīng)元吸收后在腦及脊髓中沿神經(jīng)束下行傳導；BDA示蹤結(jié)果顯示，MARK2-AAV組軸突最長可以達到600μm，而Saline、EGFP-AAV組只有450μm，MARK2-AAV組與其它兩組比較有顯著性差異(P<0.05)；在軸突增生的不同長度值中，在200μm，300μm，400μm點，BDA標記的軸突比例均要明顯高于Saline、EGFP-AAV組(P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　本研究結(jié)果表明，Nogo-66顯

13、著降低總MARK2蛋白表達及Ser212位點磷酸化程度，MARK2通過調(diào)控tau及MAP1-b參與Nogo-66的抑制信號通路；MARK2-AAV通過提高酪氨酸化α-微管蛋白水平促進軸突的生長；MARK2-AAV能夠顯著減弱Nogo-66對軸突生長的抑制作用。在脊髓損傷后，總MARK2及其在Ser212位點磷酸化程度均顯著下降；在皮層的感覺運動區(qū)立體定向注射MARK2-AAV能夠顯著促進軸突生長。表明神經(jīng)元內(nèi)MARK2/MAPs/α-t