促進軸突生長轉錄因子的篩選.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，受損的神經(jīng)軸突不能有效再生，致使被破壞的神經(jīng)環(huán)路無法有效重建，是阻礙神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復的最主要原因。目前對于損傷神經(jīng)元的再生修復治療策略主要集中于改善損傷區(qū)微環(huán)境，減少神經(jīng)軸突再生的不利因素；神經(jīng)干細胞的移植，新生的神經(jīng)元替代失去的神經(jīng)元，重建神經(jīng)環(huán)路；以及提高神經(jīng)元內源性再生能力等方法。其中，提高神經(jīng)元內源性的再生能力，是有效促進神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復的基本方法之一。轉錄因子（Transcription Factor，TF）是

2、一種DNA結合蛋白，能夠與基因上特異性的位點結合從而直接或間接的調控基因的轉錄，在發(fā)揮基因生物功能中具有重要作用。本實驗擬通過分子和細胞生物學方法篩選多種與軸突生長相關的轉錄因子，并試圖將單個轉錄因子或者多個轉錄因子聯(lián)合轉染到類神經(jīng)元細胞PC12和神經(jīng)元當中，觀察細胞突起生長情況，找出對促進細胞突起生長有效的單個轉錄因子或轉錄因子的組合。
　　實驗首先改造克隆及表達載體，獲得pCAGSJ載體；其次，通過文獻檢索，確定38種轉錄因子

3、為候選基因，利用RT-PCR及PCR的技術，獲得轉錄因子的編碼區(qū)序列（Coding DNA Sequence，CDS），并將其連接到經(jīng)過改造的真核表達載體上，經(jīng)過菌液PCR、酶切驗證和測序后確定其序列連接的正確性；最后再通過脂質體轉染的方法，將38種轉錄因子分別單獨轉染到PC12細胞中，檢測細胞突起長度。結果發(fā)現(xiàn)：上述轉錄因子對細胞突起的生長均起到了一定的促進作用，但是每個轉錄因子促進突起生長的能力各有不同，其中CREB、KLF4、p5

4、0、STAT3、Hb9、Batf、Sox10、SnoN、Lmx1a和Lhx3等10種轉錄因子對細胞突起生長的促進作用最為明顯，于是我們挑選上述10種轉錄因子作為我們后續(xù)篩選促軸突生長轉錄因子組合的候選基因。然而從上述10種轉錄因子中是否能篩選出某種組合，促進軸突生長，我們需要解決以下兩個問題：1，篩選策略；2，是否存在組合一定比單個轉錄因子效果好。于是，我們挑選了CREB、p50、STAT3和KLF4四種轉錄因子，采用N-1的策略，即4

5、個轉錄因子，每次只轉3個，觀察哪個轉錄因子對突起生長最為有效。我們采用以下轉錄因子組合：CREB+KLF4+p50、CREB+KLF4+STAT3、CREB+p50+STAT3、KLF4+p50+STAT3。結果發(fā)現(xiàn)缺少CREB和STAT3轉錄因子的組合中，細胞突起最短，說明CREB和STAT3對突起生長最為重要。隨后驗證CREB+STAT3組合效果，發(fā)現(xiàn)轉染后，細胞突起最長。該研究結果初步驗證我們的假設：即N-1策略可以用于轉錄因子組