KIF11與ZBP1的相互作用對(duì)NG108-15細(xì)胞軸突生長(zhǎng)的影響.pdf

1、第一部分、KIF11（Kinesin superfamily proteins11）是一種微管驅(qū)動(dòng)蛋白，屬于KIF5家族中的一員。KIF11蛋白是細(xì)胞內(nèi)與物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞有絲分裂相關(guān)的重要蛋白。KIF11不但調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的遷移速率和方向性，而且對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)錐的生長(zhǎng)和應(yīng)對(duì)環(huán)境變化起著重要的作用。ZBP1(Zipcode binding protein1)屬于VICKZ家族成員，是一種mRNA結(jié)合蛋白，在mRNA基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控過程中均發(fā)

2、揮著非常重要的作用。有研究表明，ZBP1可以與mRNA結(jié)合，從而影響細(xì)胞的極性和浸潤(rùn)能力。ZBP1的KH34基序與β-actin mRNA結(jié)合，形成ZBP1-mRNA復(fù)合物，我們前期研究表明，ZBP1-mRNA復(fù)合物通過ZBP1的RRM12基序與KIF11的尾部的結(jié)合來(lái)調(diào)控β-actin的表達(dá)。目前雖然發(fā)現(xiàn)KIF11與ZBP1共同作用來(lái)調(diào)節(jié)物質(zhì)的運(yùn)輸，但是它們的結(jié)合對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸有哪些影響目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。由于神經(jīng)元細(xì)胞不能連

3、續(xù)生長(zhǎng)，我們選用了可以在dbc AMP刺激下分化出軸突的類神經(jīng)細(xì)胞NG108-15。我們利用顯性負(fù)原理，使ZBP1的RRM12片段整合到細(xì)胞基因組DNA，RRM12片段與內(nèi)源型KIF11競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而干擾了KIF11與正常ZBP1的結(jié)合；同時(shí)我們用shRNA敲降技術(shù)降低內(nèi)源性的KIF11的表達(dá)，從而減少了KIF11與ZBP1的結(jié)合。
　　首先我們構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系：對(duì)照組、敲除KIF11、過表達(dá)ZBP1與KIF11結(jié)合域 R

4、RM12基序。利用慢病毒感染的方法，使NG108-15細(xì)胞基因組整合了Phage-UBC-GIR、Phage-UBC-RRM12-cherry、pGIPZ-sh-KIF11三個(gè)質(zhì)粒，通過分選型流式細(xì)胞儀篩選陽(yáng)性細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，構(gòu)建細(xì)胞系。利用Western Blot的方法鑒定sh-kdKIF11組的敲降效果。
　　接著用NG108-15細(xì)胞進(jìn)行分化實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞爬片后進(jìn)行固定、染色、拍照。統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的軸突生長(zhǎng)情況，包括軸突長(zhǎng)度和數(shù)量。我們

5、發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)組中，NG108-15細(xì)胞的軸突長(zhǎng)度比對(duì)照組長(zhǎng)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組的軸突數(shù)量減少，這說明KIF11與ZBP1的結(jié)合對(duì)NG108-15細(xì)胞軸突生長(zhǎng)有影響。另外我們證明了在NG108-15細(xì)胞軸突上存在KIF11與ZBP1的共定位。
　　第二部分、mRNA轉(zhuǎn)錄后的翻譯調(diào)控是維持細(xì)胞極性、神經(jīng)元的生長(zhǎng)的一種重要的調(diào)控方式。因此mRNA的轉(zhuǎn)錄翻譯有著重要的意義。芽殖酵母作為一種單細(xì)胞真核模式生物，方便我們進(jìn)行mRNA的翻譯調(diào)控研究。在芽

6、殖酵母中，ASH1 mRNA在子細(xì)胞芽尖的不對(duì)稱表達(dá)決定了細(xì)胞的交配類型的轉(zhuǎn)換。目前ASH1 mRNA的翻譯定位機(jī)制已經(jīng)充分的闡明，但是其在定位后的翻譯降解機(jī)制尚未了解。有研究表明，在酵母內(nèi)存在一種轉(zhuǎn)化處理小體（P-body），這種轉(zhuǎn)化處理小體內(nèi)存在著大量的mRNA水解酶類，同時(shí)P-body也有著儲(chǔ)存mRNA的功能。而P-body的組裝也受Dhh1蛋白的調(diào)控。在ASH1mRNA定位到子細(xì)胞芽尖的過程中，Puf6作為翻譯抑制因子與ASH1