產(chǎn)熱脂肪細胞(Aldhlal---細胞)分泌物對白色脂肪神經(jīng)支配及軸突生長的調(diào)控作用.pdf

1、本文主要從以下幾個方面進行論述：
　　第一部分 WT(wild type)小鼠及Aldh1a1-/-型小鼠內(nèi)臟脂肪組織內(nèi)神經(jīng)標(biāo)志物的表達。
　　目的:檢測野生型小鼠(C57BL/6J，WT)及Aldh1a1-/-型小鼠iAb(intra abdominalfat，內(nèi)臟脂肪)內(nèi)，促進神經(jīng)生長細胞因子的表達及比較;比較兩種不同細胞系(WT及Aldh1a1-/-細胞)間有關(guān)脂肪動員，產(chǎn)熱及神經(jīng)生長相關(guān)基因的表達差異。
　　方

2、法:1.WT小鼠組（n=10，雄性小鼠5只，雌性小鼠5只），Aldh1a1-/-小鼠組(n=10，雄性小鼠5只，雌性小鼠5只)。所有小鼠喂養(yǎng)高脂飼料，持續(xù)喂養(yǎng)180天。處死后，收集小鼠iAb提取蛋白，mRNA及進行免疫組化檢測TH（tyrosine hydroxylase，絡(luò)氨酸羥化酶）及Peripherin。
　　2.培養(yǎng)3T3-L1，WT及Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細胞，在細胞培養(yǎng)液中加入神經(jīng)生長誘導(dǎo)劑(forskolin，

3、10uM)，誘導(dǎo)前脂肪細胞向神經(jīng)細胞分化。兩天后，將細胞培養(yǎng)液更換成神經(jīng)細胞分化培養(yǎng)液。在第五天的時候，電鏡觀察各組細胞變化。
　　3.孵育WT(n=3)及Aldh1 a1-/-產(chǎn)熱脂肪細胞(n=3)，并使用細胞分化液開始細胞分化。在分化過程的第五天收集細胞，提取mRNA。Affymetrix GeneChip基因測序技術(shù)及nano String技術(shù)對WT細胞及Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細胞進行基因測序及信號通路分析。
　

4、　結(jié)果:1.Aldh1a1-/-小鼠iAb內(nèi)檢測出了較高水平的Peripherin及TH。Rbfox3在兩組的表達水平相近。Nestin及Synopsin在Aldh1a1-/-小鼠iAb內(nèi)表達量較WT小鼠低。
　　2.WT及3T3-L1細胞有向神經(jīng)細胞分化的潛能，而Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細胞則缺少向神經(jīng)細胞分化的潛能。
　　3.Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細胞較WT細胞表達較高水平的Pparγ，Paparα，Ucp2，

5、EPHA4, EFNA5, Itga3, Plce1, Sema3d, Sema3e, Adamts9。而Gnao1, Gng11,Hhip，Slit2的基因表達下調(diào)。
　　結(jié)論:Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細胞同WT細胞在脂肪動員，產(chǎn)熱及神經(jīng)生長相關(guān)基因表達上有很大的不同，同產(chǎn)熱及神經(jīng)生長相關(guān)的基因在Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細胞中高表達。而這些不同則可能同Aldh1a1-/-小鼠能夠?qū)狗逝窒嚓P(guān)。
　　第二部分 LTA

6、(lipolysis and thermogenesis related)促進軸突生長因子對神經(jīng)生長的調(diào)控作用的體外及體內(nèi)研究。
　　目的:肥胖小鼠（高脂飼料誘導(dǎo)及基因型肥胖）體內(nèi)LTA促進軸突生長因子表達較正常體重小鼠是否受損;檢測LTA促進軸突生長因子在體外及體內(nèi)是否均能夠有效地調(diào)控神經(jīng)生長。
　　方法:1.設(shè)置三組實驗動物:A.4月齡的WT小鼠(n=14)，喂養(yǎng)常規(guī)飼料。B.3月齡的肥胖飼料誘導(dǎo)的肥胖WT小鼠購自Jac

7、kson Laboratory，繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料3周(n=11)。C:3月齡的基因型肥胖Ob/Ob小鼠購自Jackson Laboratory，繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料3周(n=11)。處死小鼠后，取iAb，提取mRNA行NanoString檢測。比較不同組別間LTA促進軸突生長因子表達的差別。
　　2.取12-16周齡成年雌性WT小鼠脊神經(jīng)節(jié)(DRG，dorsal root ganglion)，行原代細胞培養(yǎng)。原代細胞培養(yǎng)成功后，設(shè)立5

8、組干預(yù)條件:A:DRG+神經(jīng)培養(yǎng)液組，B:DRG+NT-3(1ng/ml)+神經(jīng)培養(yǎng)液組，C:DRG+NGF(10ng/ml)+神經(jīng)培養(yǎng)液組，D:DRG+ WT細胞（或E:Aldh1a1-/-細胞）分化培養(yǎng)后第五天培養(yǎng)液+神經(jīng)培養(yǎng)液(1∶1混合)組。細胞孵育24小時后，比較各組間神經(jīng)生長情況。
　　3.18只3月齡WT雌性小鼠，高脂飼料喂養(yǎng)90天。APLL微膠囊的制作過程如下所述。然后，小鼠隨機分為4組:對照組（注射1ml PBS

9、進iAb，n=5）;空微膠囊組（注射1ml空微膠囊進iAb，n=3）;包裹WT細胞的微膠囊組（含有0.5*106個WT細胞的微膠囊1ml PBS注入iAb，n=5）;包裹Aldh1a1-/-產(chǎn)熱細胞的微膠囊組（含有0.5*106個Aldh1a1-/-細胞的微膠囊1ml PBS注入iAb，n=5）。PBS，空微膠囊，包裹細胞的微膠囊被注射入小鼠iAb后，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)80天。處死后收集含有微膠囊的iAb行蛋白組學(xué)分析及免疫組化檢查。

10、r>　　結(jié)果:1.在肥胖小鼠（高脂飼料誘導(dǎo)或基因型胖肥胖小鼠）體內(nèi)，LTA促進軸突生長因子的表達較正常體重小鼠受到明顯抑制。
　　2.Aldh1a1-/共培養(yǎng)的神經(jīng)細胞（E組），神經(jīng)細胞生長情況遠遠超過傳統(tǒng)神經(jīng)分化誘導(dǎo)劑NGF及NT3。
　　3.被膠囊包裹的Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細胞而非WT成熟脂肪細胞激發(fā)了微膠囊周圍Peripherin的表達。蛋白Peripherin的表達量在注射了Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細胞膠

11、囊的iAb內(nèi)比在注射了空膠囊的iAb內(nèi)有顯著提高。HT也在注射了Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細胞膠囊的iAb內(nèi)有表達，而在注射了WT成熟脂肪細胞的iAb的膠囊附近卻沒有表達。
　　結(jié)論:LTA促進軸突生長因子在肥胖小鼠體內(nèi)的表達受損;LTA促進軸突生長因子在體內(nèi)及體外均能有效調(diào)控神經(jīng)生長。
　　第三部分 RAR(視黃酸受體）對LTA促進軸突生長因子表達的影響及肥胖與受損的LTA的關(guān)系
　　目的:探討ALDH1A1的催化

12、產(chǎn)物RA(RA)對LTA促進軸突生長因子表達的影響及肥胖與受損的LTA促進軸突生長因子的關(guān)系。
　　方法:1.孵育DRG細胞，分為兩個組:A.培養(yǎng)液為神經(jīng)細胞培養(yǎng)液+Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細胞分化培養(yǎng)液(體積比:1/1)。B.培養(yǎng)液為神經(jīng)細胞培養(yǎng)液+Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細胞分化培養(yǎng)液（體積比:1/1）+RA(100nM)。RA在Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細胞開始分化后即刻，第二天，及第五天加入。第六天，XTI顯微鏡

13、觀察神經(jīng)細胞形態(tài)。
　　2.3T3-L1細胞分化后，加入或不加入Raid(30nM)。NanoString檢測細胞中基因表達水平(Sema3d，Sema3e，EFNA5，AdamtS9)。
　　3.3T3-L1細胞分化培養(yǎng)四天，在第五天加入RA受體的激動劑(TTNPB，50nM)或拮抗劑(BMS429，100nM)。NanoString檢測細胞中基因表達水平(Sema3d，Sema3e，EFNA5, EPHA4, Adamt

14、S9)。
　　4.5月齡，喂養(yǎng)正常飼料的WT及Aldh1a1-/-小鼠，處死后ELISA檢測血清中EFNA5含量。分化培養(yǎng)Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細胞及WT細胞，比較兩組細胞培養(yǎng)液中EFNA5的表達情況。
　　5.將神經(jīng)細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的DRG細胞分為兩組:A.細胞培養(yǎng)液中不加入EFNA5。B.細胞培養(yǎng)液中加入EFNA5復(fù)合物(30ng/ml)。共同孵育24小時后XTI顯微鏡觀察神經(jīng)細胞生長情況。
　　6.Brain

15、bow(BB) B6.Cg-Tg(Thy1-Brainbow1.0)HLich/J（n=14），喂養(yǎng)高脂飼料后140天。隨機分為PBS注射組(n=6，100ul)及EFNA5組(n=8，45ng/ml，100ul)，隔天iAb注射一個月。一個月后隨機處死兩組中各一半小鼠，比較兩組小鼠iAb中TH的表達情況。另一半小鼠放入代謝籠內(nèi)，冷刺激（4。環(huán)境6小時）后比較兩組小鼠的代謝率。
　　7.取10例白人女性(5例BMI＜30，5例BM

16、I＞=40)的皮下脂肪組織。RT-PCR檢測皮下脂肪組織中Aldh1a1、EFNA5及EPHA4的表達。
　　結(jié)果:1.RA對LTA促進軸突生長因子的分泌有重要的抑制作用。
　　2.在3T3-L1細胞中加入Rald后，同LTA分泌相關(guān)的基因:Sema3d，Sema3e，EFNA5，AdamtS9的表達上調(diào)，較對照組(未加Rald)有明顯差異。
　　3.EFNA5和EPHA4的表達受RAR調(diào)控（RAR激動劑所抑制;RAR

17、拮抗劑所誘發(fā)）。
　　4.Aldh1a1-/-小鼠較WT小鼠血清中EFNA5含量高。且分化的Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細胞較分化的WT細胞中EFNA5表達量更高。
　　5.EFNA5在體外可以促進DRG神經(jīng)細胞的生長。
　　6.同PBS組相比，注射了EFNA5組的小鼠iAb中TH的表達增高。而冷刺激后，注射了EFNA5組小鼠的基礎(chǔ)代謝率較PBS組有明顯升高。
　　7.在肥胖人群中，皮下脂肪中Aldh1a1的表達