miR-133b對(duì)軸突生長(zhǎng)的調(diào)控作用及其機(jī)制研究.pdf

1、腦、脊髓等CNS(central nerve system，中樞神經(jīng)系統(tǒng))損傷后可遺留嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，威脅人類健康，影響人們生活質(zhì)量，并且目前尚無(wú)有效的治療方法。研究表明，腦、脊髓損傷后神經(jīng)傳導(dǎo)束無(wú)法再生是導(dǎo)致神經(jīng)功能難以恢復(fù)的重要因素之一。CNS損傷后局部環(huán)境中存在神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)抑制物，包括Nogo-A、MAG（myelin-associated glycoprotein，髓磷脂相關(guān)糖蛋白）和星形細(xì)胞分泌的CSPG（Chondro

2、itin sulphate proteoglycans，硫酸軟骨素蛋白多糖）。這些抑制分子與軸突頂端的生長(zhǎng)錐接觸后，可與神經(jīng)元細(xì)胞膜上的Nogo受體等結(jié)合后激活Rho隨后活化Rho相關(guān)激酶(Rho-associated kinase，ROCK)，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，繼而引起生長(zhǎng)錐塌陷、回縮，神經(jīng)軸突停止生長(zhǎng)。
　　MicroRNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA，能夠識(shí)別其靶基因3'UTR區(qū)的互補(bǔ)位點(diǎn)并與之結(jié)合，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后途徑

3、調(diào)控靶基因蛋白的表達(dá)，其在CNS發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。最近，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA在神經(jīng)細(xì)胞軸突生長(zhǎng)、分叉、導(dǎo)向和再生中也扮演重要角色，比如miR-34a可調(diào)控小鼠軸突生長(zhǎng)和脊髓形態(tài)、功能，miR-124a與軸突分叉密切相關(guān)，而lin-4 miRNA等則與神經(jīng)軸突導(dǎo)向、靶細(xì)胞定位等相關(guān)。研究報(bào)道m(xù)iR-133b在多種腫瘤組織中差異表達(dá)，包括前列腺癌、肺癌和消化道腫瘤。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，miR-133b在人類及小鼠的中腦組織中表達(dá)

4、增高，并且能夠通過(guò)調(diào)控靶基因Pitx3的表達(dá)在中腦多巴胺神經(jīng)元的分化中起重要作用。另外Yu等人發(fā)現(xiàn)miR-133b與脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)有關(guān)，而且與卒中后功能恢復(fù)也密切相關(guān)，但是miR-133b在神經(jīng)細(xì)胞中對(duì)于軸突生長(zhǎng)的作用及相關(guān)機(jī)制尚未有研究，另外miR-133b是否與CNS損傷后軸突生長(zhǎng)抑制分子對(duì)神經(jīng)傳導(dǎo)束再生的抑制作用相關(guān)亦無(wú)報(bào)道。
　　目的:探討miR-133b對(duì)神經(jīng)細(xì)胞軸突生長(zhǎng)的調(diào)控作用及其分子機(jī)制。
　　方法:

5、
　　第一部分:制備miR-133b過(guò)表達(dá)和miR-133b inhibitor以及相應(yīng)對(duì)照慢病毒，并通過(guò)GFP（Green Fluorescent Protein，綠色熒光蛋白）表達(dá)量篩選最佳轉(zhuǎn)染效率。首先分別轉(zhuǎn)染miR-133b過(guò)表達(dá)和對(duì)照慢病毒，qRT-PCR方法檢測(cè)兩組細(xì)胞中miR-133b表達(dá)量，并進(jìn)一步分析兩組細(xì)胞軸突生長(zhǎng)情況;其次通過(guò)miR-133binhibitor干擾細(xì)胞內(nèi)miR-133b表達(dá)并觀察其對(duì)軸突生長(zhǎng)的

6、影響;另外，利用TUNEL和MTT方法檢測(cè)miR-133b對(duì)PC12細(xì)胞凋亡和增殖的影響;最后利用NGF（Nerve growth factor，神經(jīng)生長(zhǎng)因子）進(jìn)一步探究miR-133b是否與神經(jīng)分化相關(guān)。
　　第二部分:制備RhoA特異性sh-RNA和RhoA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及相應(yīng)對(duì)照質(zhì)粒。利用Western blot和qRT-PCR的方法檢測(cè)過(guò)表達(dá)或抑制miR-133b對(duì)RhoA蛋白及mRNA表達(dá)的影響及相互關(guān)系。通過(guò)sh-RNA抑

7、制細(xì)胞內(nèi)RhoA蛋白表達(dá)，進(jìn)一步研究RhoA蛋白對(duì)PC12細(xì)胞軸突生長(zhǎng)的影響，最后通過(guò)補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-133b對(duì)促進(jìn)PC12細(xì)胞軸突生長(zhǎng)的作用機(jī)制是否呈RhoA依賴性。
　　第三部分:利用Western blot方法檢測(cè)miR-133b過(guò)表達(dá)是否能促進(jìn)某些軸突生長(zhǎng)相關(guān)通路的激活（如MAPK和PI3K/Akt等）;接著干擾細(xì)胞內(nèi)miR-133b觀察這些通路可否被抑制，另外利用通路特異性抑制劑抑制關(guān)鍵分子磷酸化驗(yàn)證miR-133b

8、對(duì)軸突生長(zhǎng)的調(diào)控是否是通路依賴性;最后利用sh-RNA等技術(shù)觀察miR-133b靶基因的表達(dá)是否與這些通路的激活相關(guān)。
　　第四部分:體外提取、培養(yǎng)、純化大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞，通過(guò)慢病毒調(diào)控神經(jīng)元內(nèi)miR-133b表達(dá)，觀察其是否神經(jīng)元神經(jīng)軸突生長(zhǎng)相關(guān)。另外利用CSPG體外模擬CNS損傷后對(duì)軸突生長(zhǎng)的抑制作用，觀察miR-133b能否減弱軸突生長(zhǎng)抑制因子對(duì)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)的抑制作用。
　　結(jié)果:
　　第一部分:在PC12細(xì)胞

9、中，miR-133b調(diào)控其軸突的生長(zhǎng)，過(guò)表達(dá)miR-133b促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，相反，下調(diào)PC12細(xì)胞中miR-133b表達(dá)抑制軸突生長(zhǎng)，但是miR-133b不影響PC12細(xì)胞的神經(jīng)分化。
　　第二部分:過(guò)表達(dá)miR-133b抑制PC12細(xì)胞中RhoA蛋白的表達(dá)，但是對(duì)mRNA沒(méi)有影響。利用質(zhì)粒介導(dǎo)的shRNA干擾PC12細(xì)胞內(nèi)RhoA表達(dá)能夠模擬miR-133b對(duì)軸突生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，而共轉(zhuǎn)染RhoA質(zhì)粒和可消除miR-133b對(duì)PC1

10、2細(xì)胞軸突生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。
　　第三部分:miR-133b的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了ERK1/2和Akt絲氨酸473位點(diǎn)的磷酸化，但是對(duì)p38的磷酸化沒(méi)有影響，而且加入PI3K抑制劑LY294002和MAPK激酶MEK1抑制劑PD098059可以分別消除miR-133b對(duì)軸突生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。和過(guò)表達(dá)miR-133b類似，抑制RhoA蛋白的表達(dá)也促進(jìn)了ERK1/2和Akt(Ser473)的磷酸化。
　　第四部分:在大鼠原代皮層神經(jīng)元中，過(guò)

11、表達(dá)miR-133b能夠通過(guò)抑制RhoA蛋白的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)軸突的生長(zhǎng);神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)在CSPG包被的培養(yǎng)皿中受到抑制，而miR-133b可以逆轉(zhuǎn)其抑制作用促進(jìn)軸突生長(zhǎng)。
　　結(jié)論:綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-133b可以促進(jìn)神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)，可能的機(jī)制是miR-133b抑制了神經(jīng)細(xì)胞中RhoA蛋白的表達(dá)和RhoA/ROCK信號(hào)通路，并減弱了CSPG對(duì)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)的抑制作用，同時(shí)激活了MEK/ERK和PI3K/Akt信號(hào)通路，從而促進(jìn)