Sema3F導(dǎo)致大鼠海馬神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)錐塌陷的分子機(jī)制研究.pdf

1、癲癇(Epilepsy)是一種發(fā)作性疾病，是腦內(nèi)神經(jīng)元群過(guò)度放電所引起的陣發(fā)性腦功能障礙，小兒癲癇發(fā)病率大約3‰～6‰，其中約1/3使用藥物難以控制，稱為難治性癲癇(Refraocow Seizures)。小兒難治性癲癇原因很多，研究表明，常見的與下列一些因素有關(guān)。腦部病理性損傷：包括海馬硬化、額葉中部硬化、腦皮質(zhì)發(fā)育不良、結(jié)節(jié)性硬化、腦神經(jīng)元移行障礙、多腦回、巨小腦回。研究表明，在分子水平，苔蘚纖維出芽(Mossy Fiber Spr

2、outing，MFS)是癲癇發(fā)作后最常見的病理改變之一，與癲癇的反復(fù)自發(fā)性發(fā)作密切相關(guān)。在癇性損傷后由于門區(qū)神經(jīng)元和CA3區(qū)錐體細(xì)胞大量死亡，齒狀回內(nèi)分子層(IML)失神經(jīng)傳入，同時(shí)顆粒細(xì)胞也失去投射靶，因此苔蘚纖維芽生側(cè)枝進(jìn)入顆粒體層、IML以及CA3區(qū)始層，重建海馬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，沖動(dòng)便在再生神經(jīng)回路中迅速傳播，最終導(dǎo)致癲癇反復(fù)發(fā)作。研究表明，腦信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Semaphorin家族表達(dá)異常與MFS的發(fā)生發(fā)展具有一定的相關(guān)。
　　

3、Sema3F是Semaphorins家族中的一員，其功能包括：血管發(fā)生、細(xì)胞附著、細(xì)胞遷移、細(xì)胞的增殖、細(xì)胞骨架的組成、肺的形成、神經(jīng)細(xì)胞的連接、腫瘤的轉(zhuǎn)移、腫瘤的抑制、突觸的傳遞等。在海馬和內(nèi)嗅皮質(zhì)區(qū)的發(fā)育過(guò)程中可監(jiān)測(cè)到分泌型Sema3F，它的受體neuropilin-2僅存在于海馬。Sema3F對(duì)CA1區(qū)、CA3區(qū)的軸突有明顯的排斥作用，而對(duì)內(nèi)嗅皮質(zhì)區(qū)的軸突沒有作用。對(duì)Neuropilin-2基因敲除小鼠的研究表明，離體情況下，海馬

4、的軸突失去了對(duì)Sema3F的反應(yīng)性，并觀察到錐體苔蘚纖維束軸突發(fā)育的明顯缺陷，還在這種小鼠中觀察到該纖維束向CA1區(qū)過(guò)度生長(zhǎng)，表明Sema3F可終止苔蘚纖維的生長(zhǎng)。
　　 Semaphorins能夠限制損傷后的軸突再生，抑制異常的軸突發(fā)芽，并且參與疼痛和神經(jīng)的自發(fā)功能。在免疫系統(tǒng)，Semaphorins在各個(gè)免疫反應(yīng)環(huán)節(jié)均有重要作用。還有研究表明Semaphorins還與心血管疾病有關(guān)。Semaphorins在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作

5、用是研究比較多的，在體內(nèi)、體外的許多研究表明Semaphorins可以使軸突識(shí)別并且與另一個(gè)神經(jīng)細(xì)胞或靶位連接。Semaphorins誘導(dǎo)軸突延伸的重要機(jī)制是抑制或阻止這些神經(jīng)元軸突進(jìn)入到某些區(qū)域，例如，將Semaphorins基因突變大鼠在體內(nèi)、體外均觀察到軸突進(jìn)入到了不恰當(dāng)?shù)膮^(qū)域。在成年個(gè)體研究中也觀察到Semaphorins在一些病理、生理過(guò)程中起著重要作用，研究表明，神經(jīng)系統(tǒng)的一些疾病的發(fā)生、發(fā)展與Semaphorins功能變化

6、有關(guān)系，例如，癲癇、視網(wǎng)膜變性、阿爾海默茨病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性、精神分裂癥、帕金森氏病等。
　　 目前Sema3F生理功能的分子機(jī)制還不是很清楚，研究Sema3F的分子機(jī)制可以為癲癇、視網(wǎng)膜變性、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性、神經(jīng)損傷的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)，為癲癇，神經(jīng)損傷后再生的治療提供一個(gè)潛在的靶位點(diǎn)。
　　 實(shí)驗(yàn)材料及方法：
　　 一、新生大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)(一)動(dòng)物的選擇：新生24小時(shí)之內(nèi)的Wistar大鼠由中國(guó)醫(yī)科

7、大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。
　　 (二)大鼠原代海馬神經(jīng)元提取：取出生24h內(nèi)新生的Wistar大鼠雙側(cè)海馬提取原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元。
　　 (三)接種：用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，根據(jù)培養(yǎng)皿的不阿調(diào)節(jié)細(xì)胞終濃度，培養(yǎng)皿(2ml)，6孔板(2ml)或培養(yǎng)瓶(3ml)接種密度為2.0-3.0×106/ml，用于Western blot和Reeal-time PCR接種密度4.0-5.0×104/ml用于細(xì)胞爬片，倒置相差顯

8、微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　 (四)換液：接種后的細(xì)胞在37℃5％CO2孵箱中過(guò)夜，次日棄去接種培養(yǎng)基，37℃預(yù)熱的PBS沖洗2次，用完全培養(yǎng)基全量換液，如果試驗(yàn)需要，此后每周2-3次半量換液。
　　 二、實(shí)驗(yàn)樣本的采集和處理(一)細(xì)胞爬片處理：37℃預(yù)熱的PBS沖洗2次后，用4%的多聚甲醛固定30分鐘，去上清，PBS沖洗3次，-20℃凍存。用于熒光染色檢測(cè)，熒光共聚焦檢測(cè)，免疫組織化學(xué)檢測(cè)。
　　 (二)細(xì)胞的收

9、集：37℃預(yù)熱的PBS沖洗2次后，將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于冰塊上，用細(xì)胞刮刀輕輕將細(xì)胞刮下，收集到1.5ml離心管中，4℃離心后去上清，經(jīng)液氮轉(zhuǎn)移到-70℃冰箱保存待檢。用于Real-Time PCR和Western Blot檢測(cè)。
　　 (三)電穿孔轉(zhuǎn)染：新提取出的大鼠海馬神經(jīng)元在電轉(zhuǎn)儀內(nèi)進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染，將外源性RNA轉(zhuǎn)入原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元。
　　 (四)慢病毒轉(zhuǎn)染：培養(yǎng)24小時(shí)的大鼠海馬原代神經(jīng)元應(yīng)用慢病毒作為載體將外源性基

10、因轉(zhuǎn)入原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元。
　　 三、實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo)(一)免疫組織化學(xué)檢測(cè)：細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測(cè)，計(jì)數(shù)100個(gè)有核細(xì)胞，計(jì)算海馬神經(jīng)元提取純度。
　　 (二)免疫熒光檢測(cè)：細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)分別檢測(cè)受體Npn-2細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)分布，生長(zhǎng)錐的形態(tài)學(xué)改變并計(jì)數(shù)。
　　 (三)激光共聚焦免疫熒光檢測(cè)：細(xì)胞激光共聚焦檢測(cè)觀察Npn-2細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)分布，神經(jīng)元生長(zhǎng)錐形態(tài)學(xué)變化，并計(jì)算面積。
　　 (四)Real-T

11、ime PCR：檢測(cè)細(xì)胞中Npn-2，p53mRNA表達(dá)量的變化。
　　 (五)Western Blot：檢測(cè)細(xì)胞中Npn-2，P53蛋白含量的變化。
　　 (六)Time Lapse：動(dòng)態(tài)觀察生長(zhǎng)錐形態(tài)改變。
　　 (七)倒置顯微鏡：觀察細(xì)胞形態(tài)，計(jì)數(shù)慢病毒轉(zhuǎn)染效率。
　　 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)數(shù)資料用x±S%表示，計(jì)量資料用x±S表示，計(jì)數(shù)資料采取卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料采取方差分析，統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS11.

12、3，P<0.05提示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、新生大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)并鑒定倒置相差顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元?jiǎng)偨臃N時(shí)呈圓形，在體外培養(yǎng)30分鐘開始貼壁，2小時(shí)后大部分細(xì)胞貼壁，呈圓形或橢圓形，部分細(xì)胞開始長(zhǎng)出1到2個(gè)突起。培養(yǎng)至第2天神經(jīng)元胞體增大，呈圓形、梭形、三角形或多邊形，胞質(zhì)豐富，突起明顯延長(zhǎng)，形態(tài)多樣，可見單個(gè)、多個(gè)突起。培養(yǎng)至3天，神經(jīng)元突起延伸，像絲帶狀連接在一起開始形成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)。

13、應(yīng)用神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)特異性標(biāo)記神經(jīng)元，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，結(jié)果神經(jīng)元的純度大于95%。
　　 二、Sema3F誘導(dǎo)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)錐塌陷培養(yǎng)至第3天的新生大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)基中加入Sema3F，依據(jù)試驗(yàn)需要，應(yīng)用不同濃度作用不同時(shí)間，結(jié)果顯示，Sema3F對(duì)新生大鼠海馬神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)錐塌陷作用，表現(xiàn)為劑量依賴性和時(shí)間依賴性的特點(diǎn)。
　　 三、Sema3F作用于原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元后，可以使其受體Npn-

14、2發(fā)生內(nèi)化Sema3F10ng/ml的濃度作用海馬神經(jīng)元1小時(shí)后，神經(jīng)元細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)熒光染色后粗大的顆粒，主要集中在細(xì)胞膜的周圍，而作用30分鐘和使用同等劑量的BSA，作用1小時(shí)均未出現(xiàn)這種現(xiàn)象，說(shuō)明Npn-2受體有內(nèi)化的功能。
　　 四、Npn-2介導(dǎo)了Sema3F對(duì)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元軸突的排斥性導(dǎo)向作用選擇特異性抑制Npn2序列和對(duì)照序列進(jìn)行轉(zhuǎn)染，抑制Npn-2在原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中的表達(dá)，加入Sema3F計(jì)算軸突塌陷比例，

15、結(jié)果抑制后的神經(jīng)元軸突塌陷比率為：28.34±2.20%，對(duì)照序列轉(zhuǎn)染后塌陷比率為：99.44±0.74%，經(jīng)過(guò)卡方檢驗(yàn)P<0.01，兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 五、抑制P53功能或抑制P53表達(dá)可以導(dǎo)致原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)錐塌陷P53-siRNA和陰性對(duì)照siRNA序列通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，大鼠海馬神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)錐塌陷率為：62.22±26.30%，對(duì)照組為：13.33±7.78%，P<0.01，兩組間的差異有

16、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P53抑制劑Pifithrin-α對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)錐具有誘導(dǎo)塌陷作用。
　　 六、P53高表達(dá)可以促進(jìn)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)錐的生長(zhǎng)應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)高表達(dá)P53，P53的高表達(dá)可以促使大鼠海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)錐面積的擴(kuò)大。
　　 七、Sema3F通過(guò)作用于Npn-2，下調(diào)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中的P53的表達(dá)Sema3F作用于原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元可以抑制p53mRNA和P53蛋白表達(dá)量的下降，抑制了Npn-2后

17、這一作用被阻斷了。
　　 八、在原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中高表達(dá)P53可以減弱Sema3F導(dǎo)致軸突生長(zhǎng)錐塌陷的作用Sema3F作用P53高表達(dá)的神經(jīng)元30分鐘后塌陷率為：71.11±22.96%，Sema3F作用對(duì)照組30分鐘后塌陷率為：99.17±1.94%，P<0.01。說(shuō)明高表達(dá)P53后，Sema3F對(duì)于軸突生長(zhǎng)錐的塌陷作用被部分的抑制了，Sema3F對(duì)海馬軸突生長(zhǎng)錐的作用部分是通過(guò)降低P53表達(dá)量來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　 結(jié)論