DRAM1通過BAX調(diào)節(jié)凋亡.pdf

1、目的：研究細(xì)胞死亡過程中DRAM1對BAX的調(diào)節(jié)及DRAM1通過BAX參與凋亡的分子機(jī)制
　　方法：(1)構(gòu)建DRAM1過表達(dá)模型， Western blot法測定DRAM1對BAX蛋白水平的影響；檢測DRAM1 siRNA干擾所致的 BAX水平的變化。(2) RT-PCR法檢測DRAM1對BAX mRNA的影響。(3)使用泛素-蛋白酶體途徑抑制劑、自噬-溶酶體途徑抑制劑或干擾ATG5以抑制自噬后，觀察BAX水平的變化以確定BAX

2、的降解方式。(4)使用自噬的激動劑激活自噬后，觀察BAX的降解情況。(5)構(gòu)建DRAM1過表達(dá)模型后使用自噬-溶酶體途徑抑制劑，觀察DRAM1對BAX降解的影響。使用蛋白質(zhì)合成抑制劑檢測DRAM1對BAX半衰期的影響(6) co-IP試驗(yàn)，GST-pull down觀察DRAM1和BAX的結(jié)合情況。(7)免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測3-NP對BAX溶酶體亞細(xì)胞定位的影響，分離溶酶體后Western blot法測定BAX蛋白的溶酶體亞細(xì)胞定位以及B

3、AX定位于溶酶體后對溶酶體穩(wěn)定性的影響。(8) Western blot法觀察BAX的RNA干擾對3-NP誘導(dǎo)的BID的剪切、細(xì)胞色素C的釋放以及caspase-3激活情況的影響。
　　結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)成功的建立了DRAM1過表達(dá)的細(xì)胞模型。Western blot結(jié)果顯示DRAM1過表后BAX的蛋白水平上調(diào)；而干擾DRAM1可以抑制表阿霉素所引起的BAX水平的上調(diào)。RT-PCR的結(jié)果顯示過表達(dá)DRAM1并不能上調(diào)BAX的mRNA水平

4、。Western blot結(jié)果顯示抑制泛素-蛋白酶體途徑后BAX蛋白并沒有出現(xiàn)累積，而自噬-溶酶體途徑抑制劑或ATG5的RNA干擾可以上調(diào)BAX的蛋白水平。在使用雷帕霉素激活自噬后，由于此時雷帕霉素引起了DRAM1水平的升高，BAX的蛋白水平也隨之升高；而在干擾DRAM1的前提下激活自噬可以加速BAX蛋白的降解。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法構(gòu)造DRAM1過表達(dá)模型后再使用自噬-溶酶體途徑抑制劑，BAX的蛋白水平并沒有出現(xiàn)進(jìn)一步的升高；半衰期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示D

5、RAM1過表達(dá)的細(xì)胞系，其BAX蛋白的半衰期長于正常細(xì)胞系。co-IP和GST-pull down結(jié)果顯示DRAM1可以與BAX發(fā)生相互作用；免疫細(xì)胞化學(xué)和分離溶酶體的結(jié)果同時顯示了DRAM1可以招募BAX至溶酶體并且定位于溶酶體的BAX可以釋放溶酶體酶Cathepsin-B。BAX的RNA干擾實(shí)驗(yàn)顯示BAX參與了BID的剪切、細(xì)胞色素C的釋放以及caspase-3激活。
　　結(jié)論：DRAM1可以上調(diào)BAX的蛋白水平，但DRAM1