熊去氧膽酸通過調(diào)節(jié)Bax信號(hào)途徑抑制肝細(xì)胞凋亡.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、研究背景和目的:
   研究表明,在各種急慢性肝病中,凋亡是肝細(xì)胞損害的基本特征,它可能是不同類型肝病肝細(xì)胞死亡的最終通路,如酒精性肝病、病毒性、自身免疫性肝炎、膽汁淤積性肝病、肝臟代謝性疾病等。通過藥物抑制肝細(xì)胞的凋亡,減輕肝細(xì)胞的損傷,保護(hù)肝細(xì)胞是治療肝病的一個(gè)重要的研究方向。
   膽汁淤積性肝病是由于肝細(xì)胞分泌受損使肝毒性膽汁酸在肝細(xì)胞內(nèi)增多引起的。盡管在膽汁於積時(shí)肝細(xì)胞受損的機(jī)制是多因素的,但疏水性膽汁酸誘導(dǎo)的

2、凋亡可能是一個(gè)主要的作用。在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中,疏水性的膽汁酸被證實(shí)可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡。比如,給予50μmol/L脫氧膽酸(deoxycholic acid,DCA)8h后,原始的大鼠肝細(xì)胞的凋亡率可達(dá)20%。
   腫瘤抑制蛋白p53是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)有關(guān)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)。最近研究表明,p53可能是通過轉(zhuǎn)錄依賴和轉(zhuǎn)錄不依賴的機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。普遍認(rèn)為p53發(fā)動(dòng)凋亡是通過作為序列特異性的轉(zhuǎn)錄激活因子活化了前凋亡基因

3、,如Bax、Noxa和PUMA等。這些蛋白轉(zhuǎn)位到線粒體,從而降低線粒體膜電位和促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放,進(jìn)而活化了Apaf—1/Caspase—9的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
   熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)是一親水性二羥膽酸,具有利膽、細(xì)胞保護(hù)、拮抗疏水性膽汁酸的細(xì)胞毒性、抗凋亡、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等作用。大量的臨床研究表明UDCA對(duì)多種膽汁淤積性肝病如原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎和肝內(nèi)膽汁淤積癥

4、等具有顯著的療效。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明,UDCA保護(hù)肝細(xì)胞損傷主要是通過抗凋亡作用,而其確切機(jī)制還不是很清楚。本研究以大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)定向分化21天后的肝細(xì)胞為模型探討UDCA在肝細(xì)胞凋亡過程中的作用及其作用機(jī)制。
   研究方法:
   從大鼠股骨骨髓中分離骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,在體外誘導(dǎo)分化為成熟的肝細(xì)胞。用PBS(作為對(duì)照組),100μmol/L DCA,100μmol/L DCA+100μ mol/L UDCA及100

5、μmol/L UDCA分別處理肝細(xì)胞。用Hoechst33258染核和測(cè)定Caspase3的活性來評(píng)估肝細(xì)胞的凋亡程度;用RT—PCR和Realtime PCR檢測(cè)凋亡過程中p53及BaxmRNA的表達(dá):用免疫組化的方法檢測(cè)凋亡過程中Bax蛋白的表達(dá)。
   研究結(jié)果:
   1.DCA可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡
   用Hocchst33258染核對(duì)細(xì)胞的凋亡進(jìn)行評(píng)估,相對(duì)于對(duì)照組,肝細(xì)胞在DCA作用8h和18h后出現(xiàn)

6、了明顯的凋亡(p<0.05)。同樣,Caspase3活性在DCA的作用8h和18h后也明顯增高(p<0.05)。可見,DCA可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡。
   2.UDCA可以抑制DCA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡
   用Hoechst33258染核對(duì)細(xì)胞的凋亡進(jìn)行評(píng)估,UDCA的給予則可以明顯抑制DCA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡(p<0.05)。而UDCA的同時(shí)給予則可以明顯的抑制DCA誘導(dǎo)Caspase3活性的升高(p<0.05)。可見,UD

7、CA可以抑制DCA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。
   3.UDCA可以抑制DCA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡過程中p53及Bax mRNA和Bax蛋白的表達(dá)
   用Realtime PCR方法分析各個(gè)實(shí)驗(yàn)組在作用8h和18h后,p53及Bax的mRNA的表達(dá)情況。可以發(fā)現(xiàn),在加DCA后,無論是8h還是18h,相對(duì)于對(duì)照組,肝細(xì)胞的p53及BaxmRNA表達(dá)都明顯增加(p<0.05);而同時(shí)加入U(xiǎn)DCA可以發(fā)現(xiàn)p53及Bax的表達(dá)明顯減少(p

8、<0.05)。同時(shí)還用RT-PCR的方法檢測(cè)了Bax mRNA的表達(dá),其結(jié)果和Realtime PCR的是一致的。用免疫組化方法檢測(cè)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組在作用8h和18h后Bax蛋白的表達(dá)。相對(duì)于對(duì)照組,DCA作用組的Bax蛋白的表達(dá)明顯增加(p<0.05);而同時(shí)加入U(xiǎn)DCA可以發(fā)現(xiàn)Bax蛋白的表達(dá)明顯減少(p<0.05)。由此可見,DCA可能是通過活化p53/Bax信號(hào)途徑誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡,而UDCA可能是通過抑制p53/Bax信號(hào)通路而阻止

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