已酮可可堿通過Raf途徑抑制大鼠肝星狀細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis)是在肝臟慢性損傷與修復(fù)愈合的過程中形成的一種病理改變，細(xì)胞外間質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)的過度合成與沉積是其主要特征。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)，也稱貯脂細(xì)胞，并不是肝臟的主要細(xì)胞，僅占肝臟細(xì)胞的5％。在正常肝臟組織中，HSC處于靜息狀態(tài)；然而，在肝損傷時(shí)HSC可被激活發(fā)生明顯的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能變化：分泌多種細(xì)胞因子、增殖和合成各

2、種ECM的能力明顯增強(qiáng)。因此，肝纖維化主要是由于HSC的激活導(dǎo)致ECM的大量增加，引起肝功能的損傷，并最終導(dǎo)致肝硬化。在HSC中各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同參與肝纖維化的形成，因此，研究不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，同時(shí)尋找新的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)肝纖維化的形成機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，有助于對(duì)其發(fā)病機(jī)制更全面更深刻的理解。 Raf-1蛋白激酶由648個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量為70～74kD，活化后具有絲/蘇氨酸蛋白激酶活性。Raf激酶的3個(gè)同工酶包括A-R

3、af、B-Raf與C-Raf(Raf-1)。Raf激酶主要功能是通過Ras/Raf/MEK/ERK通路，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，引起細(xì)胞的增殖和分化。此外，有研究表明Raf-l激活通過MEK/MERK通路介導(dǎo)抑制細(xì)胞凋亡。Raf-1激活有賴于酪氨酸蛋白激酶的活化。在Ras/Raf-1增殖信號(hào)途徑中，Raf-1位于Ras的下游，其激活的初始事件是生長因子激活特異的受體酪氨酸激酶，活化的受體首先作用于Grb2-Sos蛋白復(fù)合物，Sos可使Ras活

4、化，后者進(jìn)一步激活Raf-1。Raf-1被激活后即繼續(xù)激活其下游的MEK和MAPK，最終通過對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子表達(dá)的影響而將細(xì)胞增殖信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)。表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)系一種常見的細(xì)胞因子，對(duì)上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞都有促進(jìn)增殖的作用。 己酮可可堿(pentoxifylline，PTX)為甲基黃嘌呤衍生物，是磷酸二酯酶抑制劑，目前主要用于外周血管病的治療。體外研究顯示PT

5、X具有增加細(xì)胞內(nèi)cAMP及改善血流動(dòng)力學(xué)、免疫抑制和抗纖維化的作用。 迄今，Ras/Raf/MEK/Erk信號(hào)傳遞通路為近年來信號(hào)傳導(dǎo)方面研究最活躍的熱點(diǎn)之一，很多研究表明該通路具有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化等功能，但在肝纖維化發(fā)生中的作用研究較少。Raf是該信號(hào)通路中的重要一環(huán)。Raf-1能否被激活、是否能準(zhǔn)確地下傳信號(hào)對(duì)于細(xì)胞是否出現(xiàn)增殖效應(yīng)至關(guān)重要。為此，我們應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，探討Ras/Raf信號(hào)通路阻斷劑PTX對(duì)大鼠HSC

6、中Raf磷酸化水平的抑制作用，從而為肝纖維化的發(fā)病機(jī)制和有效治療提供理論依據(jù)。 目的：探討Ras/Raf信號(hào)通路阻斷劑己酮可可堿對(duì)EGF刺激的大鼠HSC中Raf磷酸化水平的抑制作用，以及該信號(hào)通路對(duì)HSC增殖、凋亡的影響。 方法：應(yīng)用含8％胎牛血清、100 IU·mL-1青霉素、100μg·mL-1鏈霉素、4 mmol·L-1谷氨酰胺及1 mol·L-1HEPES的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5％CO2條件下體外培養(yǎng)HS℃利

7、用EGF誘導(dǎo)激活HSC后，以一定濃度的PTX阻斷Ras/Raf通路。采用Western blotting方法檢測(cè)HSC中p-Raf的蛋白表達(dá)；采用流式細(xì)胞學(xué)的方法檢測(cè)PTX對(duì)HSC凋亡的影響；采用MTT法等測(cè)定PTX對(duì)HSC的增殖抑制作用。結(jié)果：①PTX抑制HSC中Raf磷酸化水平。Westernblotting方法分析示：EGF+PTX(40μg·mL-1)組p-Raf表達(dá)較EGF+PTX(20 μg·mL-1)組間無明顯差異(P＞0

8、.05)；EGF組p-Raf表達(dá)明顯較對(duì)照組增高(P＜0.01)；EGF+PTX(10μg·mL-1)組p-Raf表達(dá)較對(duì)照組減少了31.87％(P＜0.01)。PTX干預(yù)濃度越高，蛋白表達(dá)下降趨勢(shì)越明顯，并呈劑量依賴性。用PTX干預(yù)EGF刺激的HSC，EGF+PTX(2h)組p-Raf表達(dá)較與對(duì)照組相比無明顯差異(P＞0.05)；PTX干預(yù)時(shí)間越長，p-Raf表達(dá)下降趨勢(shì)越明顯，呈時(shí)間依賴性。②PTX對(duì)HSC凋亡的影響：流式細(xì)胞學(xué)方法

9、測(cè)定顯示：PTX干預(yù)HSC 24h后，與空白對(duì)照組、EGF組、PTX(4h)組與PTX(8h)組相比，可明顯促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。表明在EGF激活p-Raf后，抑制HSC凋亡，而PTX抑制p-Raf表達(dá)后，可有效的促進(jìn)細(xì)胞凋亡。③PTX抑制HSC增殖。倒置顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察，新傳代的HSC呈圓形，富含折光脂滴。接種1 h部分細(xì)胞開始黏附，4.5 h伸展，24 h細(xì)胞突起明顯伸長、增多。隨培養(yǎng)時(shí)間延長，細(xì)胞漸呈典型星狀形態(tài)，突起多而長，并呈簇狀

10、生長。應(yīng)用PTX干預(yù)HSC 4h后，HSC的星狀或梭狀突起開始回縮，逐漸變?yōu)榭s水狀的圓形細(xì)胞，細(xì)胞間隙增大，由致密狀變?yōu)榫W(wǎng)格狀，12h開始有細(xì)胞脫落，24 h脫落細(xì)胞明顯增多，懸浮于上清中，但細(xì)胞膜一直保持完整。MTT法：EGF刺激HSC后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞生長明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01；EGF+PTX(4h)組、EGF+PTX(8h)組、EGF+PTX(24h)組與對(duì)照組相比細(xì)胞增殖明顯受到抑制，均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.