氟非尼酮抑制肝星狀細(xì)胞增殖機制的研究.pdf

1、本文對氟非尼酮抑制肝星狀細(xì)胞增殖機制進(jìn)行了研究。本研究分為四個部分：
　　第一章：氟非尼酮對肝纖維化的療效觀察。
　　背景：肝纖維化是各種肝病進(jìn)展到肝硬化的中間階段。目前認(rèn)為，肝纖維化有完全逆轉(zhuǎn)的可能。如何防治肝纖維化是目前肝臟病領(lǐng)域的研究熱點之一。然而到目前為止，臨床試驗尚未發(fā)現(xiàn)能夠完全阻止肝纖維化進(jìn)展的藥物，因此，治療肝纖維化的新藥研究亟待開展。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)增多是肝纖維化

2、的主要病理特征。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)是產(chǎn)生ECM的主要細(xì)胞，在肝纖維化中發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，HSC的增殖在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，是治療肝纖維化的關(guān)鍵。氟非尼酮(1-(3-氟苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮，fluorofenidone，AKF-PD）是本課題組合成得到的一種新的吡啶酮類化合物，已獲得2項國家發(fā)明專利。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)AKF-PD可以抑制肝、腎纖維化，

3、本實驗將進(jìn)一步驗證AKF-PD對肝纖維化的療效。
　　目的：觀察AKF-PD對二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化肝組織炎癥評分、纖維化評分、Ⅰ、Ⅲ型膠原以及α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表達(dá)的影響，進(jìn)一步驗證AKF-PD對肝纖維化的療效。
　　方法：以DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型。Wistar大鼠（144只）隨機分為正常組和DMN模型組

4、。造模2周后，各組隨機處死大鼠12只，分別行HE和Masson染色，觀察肝纖維化模型成模情況。余下的模型組再隨機分為DMN模型組、AKF-PD治療組、吡非尼酮(Pirfenidone，PFD)治療組;繼續(xù)造模1周，同時從第三周造模開始予以各種藥物治療。治療4周后留取肝組織標(biāo)本，分別行HE和Masson染色觀察大鼠纖維化成模情況及藥物療效，行免疫組化觀察Ⅰ，Ⅲ型膠原的表達(dá)，Western blot檢測α-SMA的表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴

5、給予DMN腹腔注射2周后，模型組大鼠肝組織炎癥評分及纖維化評分與正常組相比明顯升高p＜0.05），表明造模成功。⑵繼續(xù)造模1周，同時藥物治療4周后，DMN模型組大鼠肝組織炎癥評分、纖維化評分、Ⅰ，Ⅲ型膠原以及α-SMA表達(dá)與正常組相比明顯升高(p＜0.05);與模型組相比，AKF-PD及PFD治療后，能顯著改善DMN模型組大鼠肝組織炎癥評分、纖維化評分，減少Ⅰ，Ⅲ型膠原以及α-SMA的表達(dá)(p＜0.05)。
　　結(jié)論：①AKF-P

6、D具有治療肝纖維化的作用。②AKF-PD能抑制肝星狀細(xì)胞的活化和增殖，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)形成，有效減輕病變肝臟纖維化程度，提示抑制肝星狀細(xì)胞的活化和增殖是AKF-PD治療肝纖維化的機制之一。
　　第二章：大鼠原代肝星狀細(xì)胞的分離，培養(yǎng)及鑒定。
　　背景：肝纖維化是各種肝病進(jìn)展到肝硬化的中間階段。目前認(rèn)為，肝纖維化有完全逆轉(zhuǎn)的可能。肝纖維化的病理特征為細(xì)胞外基質(zhì)增多。肝星狀細(xì)胞是產(chǎn)生ECM的主要細(xì)胞，在肝纖維化中發(fā)揮重要的作用

7、。原代肝星狀細(xì)胞較永生型肝星狀細(xì)胞株更適合于肝纖維化發(fā)病機制的研究。本實驗將從正常SD大鼠體內(nèi)分離原代肝星狀細(xì)胞，并進(jìn)行培養(yǎng)，鑒定，以進(jìn)行肝纖維化發(fā)病機制方面的研究。
　　目的：從正常SD大鼠肝臟中分離原代肝星狀細(xì)胞，并進(jìn)行培養(yǎng)，鑒定。
　　方法：采用CollagenaseⅣ+Pronase肝臟原位灌注法從正常SD大鼠肝臟中分離原代肝星狀細(xì)胞（11.3％Nycodenz梯度離心）。并進(jìn)行體外培養(yǎng)，于熒光顯微鏡下進(jìn)行熒光鑒定。

8、同時采用免疫組化的方法，檢測結(jié)蛋白(Desmin)，α-SMA的表達(dá)，對HSC進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果：⑴采用CollagenaseⅣ+Pronase肝臟原位灌注法從正常SD大鼠肝臟中成功分離原代肝星狀細(xì)胞，并在37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中成功培養(yǎng)。⑵分離后第2天，在熒光顯微鏡下觀察到，HSC于328nm處自發(fā)藍(lán)綠色熒光，為HSC逐漸活化的表現(xiàn)。⑶分離后10-14天，HSC已完全活化，具備肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast)的特

9、性，表達(dá)特征性的結(jié)蛋白和α-SMA。
　　結(jié)論：成功進(jìn)行大鼠原代肝星狀細(xì)胞的分離，培養(yǎng)及鑒定。
　　第三章：氟非尼酮對肝星狀細(xì)胞增殖的影響及作用機制研究。
　　背景：氟非尼酮是本課題組合成得到的一種新的吡啶酮類化合物，已證明其具有較強的抗肝纖維化作用。目前AKF-PD抗肝纖維化的機制還不十分明確，本課題組前期的研究結(jié)果顯示:AKF-PD能抑制肝星狀細(xì)胞的增殖，而不影響其凋亡。第一章的研究結(jié)果顯示，AKF-PD能抑制肝星

10、狀細(xì)胞的活化和增殖，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)形成，有效減輕病變肝臟纖維化程度，提示抑制肝星狀細(xì)胞的活化和增殖是AKF-PD治療肝纖維化的機制之一。本實驗將觀察AKF-PD在體外對肝星狀細(xì)胞活化和增殖的影響，并探討其作用機制。
　　目的：在體外水平觀察AKF-PD對HSC增殖的影響;觀察AKF-PD對HSC細(xì)胞周期的影響;探討AKF-PD抑制肝星狀細(xì)胞增殖的作用機制。
　　方法：⑴以PDGF（10ng/ml）刺激HSC細(xì)胞，以AKF

11、-PD不同濃度（1mM，2mM）作用HSC細(xì)胞24，48小時，MTT法檢測HSC細(xì)胞增殖。⑵以AKF-PD不同濃度(1mM，2mM)作用HSC細(xì)胞48小時，PI流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞周期。⑶以PDGF（10ng/ml）刺激HSC細(xì)胞建立肝星狀細(xì)胞增殖模型。分為正常組，PDGF刺激組，PDGF+AKF-PD(2mM)組，PDGF+PFD（2mM）組，藥物預(yù)處理24小時后加入PDGF(10ng/ml)繼續(xù)培養(yǎng)24小時，采用Western blo

12、t檢測α-SMA、Ⅰ型膠原、cyclin D1、cyclin E、p27kip1的表達(dá)。⑷將HSC細(xì)胞分為正常組，單獨AKF-PD（2mM）組，PDGF刺激組，PDGF+AKF-PD(2mM)組，抑制劑組，PDGF+PFD(2mM)組，然后用AKF-PD(2mM)和PFD(2mM)預(yù)處理HSC細(xì)胞24小時，在提取蛋白前15分鐘加入PDGF（10ng/ml），采用Western blot檢測p-ERK、p-MEK、p-Akt(S473,T

13、308)和p-p70s6K的表達(dá)。
　　結(jié)果：①PDGF（10ng/ml）刺激HSC，AKF-PD不同濃度(1mM，2mM)作用HSC細(xì)胞24，48小時后，HSC的增殖被不同程度的抑制，抑制作用隨著AKF-PD濃度的增加和作用時間的延長而增強。②AKF-PD不同濃度(1mM，2mM)作用HSC細(xì)胞48小時，PI流式細(xì)胞法檢測，HSC被AKF-PD阻滯在細(xì)胞生長的G1期。阻滯作用隨著AKF-PD濃度的增加而增強。③PDGF刺激HSC

14、細(xì)胞24小時后，α-SMA(p＜0.05)、Ⅰ型膠原(p＜0.05)、cyclin D1(p＜0.05)以及cyclin E的表達(dá)(p＜0.05)顯著上調(diào)，p27kip1的表達(dá)顯著下調(diào)(p＜0.05)。AKF-PD和PFD治療后能夠顯著抑制α-SMA(p＜0.05)、Ⅰ型膠原(p＜0.05)、cyclin D1(p＜0.05)以及cyclin E的表達(dá)(p＜0.05)，上調(diào)p27kip1的表達(dá)(p＜0.05)。AKF-PD(2mM)組的

15、治療效果與同等劑量的PFD組相當(dāng)(p＞0.05)。④PDGF刺激HSC細(xì)胞15分鐘后，p-ERK、p-MEK、p-Akt(S473，T308)和p-p70S6K的表達(dá)均顯著上升，AKF-PD和PFD能有效減少ERK、MEK、Akt(S473，T308)和p70S6K的磷酸化(p＜0.05)。AKF-PD(2mM)組的治療效果與同等劑量的PFD組相當(dāng)(p＞0.05)。
　　結(jié)論：⑴AKF-PD具有抑制活化的肝星狀細(xì)胞增殖的作用。⑵A

16、KF-PD能阻滯活化的肝星狀細(xì)胞的細(xì)胞周期。⑶AKF-PD抑制活化的肝星狀細(xì)胞增殖的療效與同等劑量的PFD相當(dāng)。⑷AKF-PD抑制肝星狀細(xì)胞增殖可能是通過抑制ERK/MAPK及PI3K/Akt信號通路。
　　第四章：氟非尼酮抑制肝星狀細(xì)胞增殖的作用靶點。
　　背景：氟非尼酮是本課題組合成得到的一種新的吡啶酮類化合物，已證明其具有較強的抗肝纖維化作用。目前AKF-PD抗肝纖維化的機制還不十分明確，第三章的研究結(jié)果顯示AKF-P

17、D抑制肝星狀細(xì)胞增殖可能是通過抑制ERK/MAPK及PI3K/Akt信號通路。然而AKF-PD在這兩個信號通路中的作用靶點還不確切。本章實驗將觀察AKF-PD在ERK/MAPK及PI3K/Akt信號通路中的作用靶點，進(jìn)一步明確其作用機制。
　　目的：在體外水平觀察AKF-PD在ERK/MAPK及PI3K/Akt信號通路中的作用靶點;觀察AKF-PD通過作用靶點對HSC細(xì)胞Ⅰ型膠原及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白cyclin D1表達(dá)的影響，探討

18、AKF-PD抑制肝星狀細(xì)胞增殖的作用機制。
　　方法：⑴以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染持續(xù)活化ERK的質(zhì)粒MEK-Q56P入HSC，AKF-PD(2mM)作用HSC24小時，采用Western blot方法檢測p-ERK1/2; AKF-PD(2mM)作用HSC48小時，采用Western blot方法檢測Ⅰ型膠原及cyclin D1的表達(dá)。⑵以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染持續(xù)活化PI3K的質(zhì)粒PI3KP110α-CAAX入HSC，AKF-PD(2mM)作用HS

19、C24小時，采用Westernblot檢測p-Akt; AKF-PD(2mM)作用HSC48小時，采用Westem blot方法檢測Ⅰ型膠原及cyclin D1的表達(dá)。
　　結(jié)果：①轉(zhuǎn)染持續(xù)活化ERK的質(zhì)粒MEKQ56P入HSC后，p-ERK1/2(p＜0.05)、Ⅰ型膠原(p＜0.05)及cyclin D1的表達(dá)(p＜0.05)顯著上調(diào)，AKF-PD治療后能夠顯著抑制ERK的磷酸化(p＜0.05)，抑制Ⅰ型膠原(p＜0.05)以

20、及cyclin D1的表達(dá)(p＜0.05)。②轉(zhuǎn)染持續(xù)活化PI3K的質(zhì)粒PI3K P110α-CAAX入HSC后，p-Akt(p＜0.05)、Ⅰ型膠原(p＜0.05)及cyclin D1的表達(dá)(p＜0.05)顯著上調(diào)，AKF-PD治療后能夠顯著抑制Akt的磷酸化(p＜0.05)，抑制Ⅰ型膠原(p＜0.05)以及cyclin D1的表達(dá)(p＜0.05)。
　　結(jié)論：⑴AKF-PD通過ERK/MAPK信號通路抑制肝星狀細(xì)胞增殖，其作用