趨化因子配體6促進(jìn)肝細(xì)胞增殖并抑制肝星狀細(xì)胞分泌I型膠原的分子機制研究.pdf

1、背景及目的：
　　逆轉(zhuǎn)肝纖維化是目前研究的熱點，有效促進(jìn)肝細(xì)胞再生是實現(xiàn)肝纖維化逆轉(zhuǎn)的必備條件。肝細(xì)胞增殖及Ⅰ型膠原降解是實現(xiàn)肝細(xì)胞再生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，研究表明，CXCR1表達(dá)缺失抑制肝細(xì)胞再生，CXCL6作為CXCR1的主要配體，在肝細(xì)胞再生中的作用值得探討。在本研究中我們將探討趨化因子配體6（CXCL6）對肝細(xì)胞增殖和肝星狀細(xì)胞合成及分泌I型膠原的影響，以期闡明CXCL6促進(jìn)肝細(xì)胞再生的分子機制。
　　方法：
　　1.

2、建立動物模型：采用40%四氯化碳皮下注射的方法構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，其中模型組32只，對照組12只。分別于開始實驗后的第2、4、6和8周末處死8只模型組大鼠及3只對照組大鼠。留取肝臟組織進(jìn)行HE和Masson染色觀察大鼠肝臟病理學(xué)變化；ELISA法檢測各組大鼠血清中CXCL6、IL8、TNF-α、MCP-1、COLI和COLIII水平變化；Real-time PCR和Western blot法檢測大鼠肝臟組織中CXCL6及其受體mRNA

3、和蛋白水平的表達(dá)變化；免疫組織化學(xué)染色法觀察CXCL6在大鼠肝臟內(nèi)的表達(dá)位點。
　　2.細(xì)胞免疫熒光法檢測大鼠BRL肝細(xì)胞株及HSC-T6細(xì)胞株中CXCL6、CXCR1和CXCR2的表達(dá)。
　　3.化學(xué)合成CXCR1-siRNA和CXCR2-siRNA，Real-time PCR法檢測其轉(zhuǎn)染效率。
　　4.細(xì)胞分組：BRL細(xì)胞株和HSC-T6細(xì)胞株可被分為：①陰性對照組；②CXCL6（100ng/ml）干預(yù)組；③CXC

4、R1-siRNA干預(yù)組；④CXCR2-siRNA干預(yù)組；⑤CXCL6（100ng/ml）+CXCR1-siRNA干預(yù)組；⑥CXCL6（100ng/ml）+CXCR2-siRNA干預(yù)組。
　　5. MTT法檢測CXCL6、CXCR1-siRNA和CXCR2-siRNA對大鼠BRL細(xì)胞株和HSC-T6細(xì)胞株增殖能力的影響。
　　6.ELISA法檢測HSC-T6細(xì)胞各干預(yù)組上清液中I型膠原的含量。
　　7.Western b

5、lot法檢測BRL細(xì)胞株各干預(yù)組中PCNA、NF-κB、STAT3和p-STAT3的表達(dá)變化；檢測HSC-T6細(xì)胞株各干預(yù)組中I型膠原的表達(dá)變化。
　　8.病例收集：收集50例慢性乙型肝炎患者的血清標(biāo)本及臨床資料，并根據(jù)Scheuer分期將其分為S0-S4期肝纖維化，每組各10例。留取血清標(biāo)本采用ELISA法檢測CXCL6的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.基于四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型的實驗表明：①成功構(gòu)建四氯化碳誘

6、導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，2周末模型組匯管區(qū)未見明顯炎性細(xì)胞浸潤及纖維沉積；4周末模型組匯管區(qū)可見的大量炎性細(xì)胞浸潤及少量纖維沉積；6周末匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤加重及膽管增生，大量纖維沉積但未形成假小葉；8周末時可見部分肝細(xì)胞壞死，假小葉形成；②Real-time PCR及Western blot結(jié)果表明，肝組織內(nèi)CXCL6及其受體mRNA和蛋白水平隨纖維化程度加重而逐步提高；③ELISA結(jié)果顯示，大鼠血清中CXCL6的水平同樣隨肝纖維化程度加

7、重而上調(diào)；④免疫組織化學(xué)染色法表明，CXCL6在正常對照組大鼠的肝臟中可表達(dá)與肝臟腺泡3帶，隨著肝纖維化進(jìn)展CXCL6不僅在肝臟內(nèi)表達(dá)增多，還可表達(dá)與匯管區(qū)的間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。⑤相關(guān)性分析顯示，自造模2W起CXCL6水平即與IL8及TNF-α水平密切相關(guān)；自造模6W起，CXCL6水平與COLI水平相關(guān)；造模8周時CXCL6與COLIII呈現(xiàn)相關(guān)性；CXCL6與MCP-1在造模2周時及8周時呈現(xiàn)相關(guān)性。
　　2.基于大鼠BRL肝細(xì)胞株的實

8、驗表明：①激光共聚焦結(jié)果顯示，CXCL6可表達(dá)與BRL細(xì)胞的胞質(zhì)，CXCR1和CXCR2則均表達(dá)與細(xì)胞的胞核；②MTT結(jié)果表明，CXCL6（10-1000ng/ml）在不同時間點（12、24、48及72小時）均可刺激BRL細(xì)胞增殖；CXCR1-siRNA可抑制BRL細(xì)胞增殖；CXCR2-siRNA對BRL細(xì)胞的增殖能力無明顯影響；CXCR1-siRNA干擾BRL細(xì)胞后，CXCL6無法促進(jìn)BRL細(xì)胞增殖。③Western blot結(jié)果顯示

9、，CXCL6可上調(diào)BRL細(xì)胞中PCNA和NF-κB的蛋白水平，但對p-STAT3的蛋白水平無明顯影響；此外，CXCR1-siRNA可顯著下調(diào)BRL細(xì)胞中NF-κB、STAT3和p-STAT3的水平；CXCR2-siRNA僅可顯著下調(diào)BRL細(xì)胞中p-STAT3的水平。
　　3.基于大鼠HSC-T6細(xì)胞株的實驗表明：①激光共聚焦結(jié)果顯示：CXCL6和CXCR1可表達(dá)與HSC-T6細(xì)胞的胞質(zhì)中，CXCR2則可表達(dá)與細(xì)胞的胞核中；②MTT

10、結(jié)果顯示，CXCL6、CXCR1-siRNA和CXCR2-siRNA對HSC-T6的增殖能力均無明顯影響；③ELISA結(jié)果顯示：CXCL6（100ng/ml）可顯著降低HSC-T6細(xì)胞上清液中I型膠原的含量；而CXCR1-siRNA和CXCR2-siRNA對細(xì)胞上清液中I型膠原的含量無明顯影響；④Western blot結(jié)果顯示，與ELISA結(jié)果一致，CXCL6可降低HSC-T6細(xì)胞內(nèi)I型膠原的含量，CXCR1-siRNA和CXCR2-

11、siRNA對細(xì)胞內(nèi)I型膠原的含量無明顯影響。
　　4.基于慢性乙型肝炎患者的研究表明：①ELISA結(jié)果顯示，CXCL6水平隨患者纖維化分期及炎癥分級的增高而上調(diào)；②慢性乙型肝炎患者血清中CXCL6水平在輕度纖維化與顯著纖維化患者之間存在顯著差異；③相關(guān)性分析表明，肝纖維化進(jìn)程中CXCL6水平與ALT、AST以及白蛋白的水平呈正性相關(guān)關(guān)系。
　　結(jié)論：
　　肝纖維化進(jìn)程中含量隨疾病嚴(yán)重程度逐漸上調(diào)的CXCL6可通過CXC