核因子-κBp65反義寡核苷酸對肝星狀細(xì)胞增殖、NF-κB活性、IL-6及Ⅰ型膠原的影響.pdf

1、【目的】通過轉(zhuǎn)染NF-KBp65反義寡核苷酸(ASODN)進(jìn)入大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC)，了解HSC的增殖、NF-kB活性和IL-6、I型膠原的產(chǎn)生情況，探討NF-kBp65 ASODN治療肝纖維化的可能機(jī)制。 【方法】采用膠原酶灌注消化，密度梯度離心法分離大鼠HSC，臺(tái)盼藍(lán)染色排斥法鑒定HSC的存活率，并用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定HSC。應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染NF-kBp65 ASODN進(jìn)入HSC，臺(tái)盼藍(lán)染色排斥法檢測NF-kBp6

2、5ASODN對HSC的毒性實(shí)驗(yàn)。MTT法測定脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NF-KBp65 ASODN對HSC增殖影響。采用EMSA法檢測NF-kB活性變化。采用RT-PCR法測定HSC內(nèi)IL-6和I型膠原mRNA的表達(dá)水平，并采用ELISA法測定HSC分泌IL-6和I型膠原蛋白的濃度。 【結(jié)果】一只大鼠HSC得率為約3x10<'7>個(gè)，經(jīng)0.4％臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞存活率約97％；培養(yǎng)13～14d后HSC長滿單層，此時(shí)HSC呈現(xiàn)典型成纖維細(xì)胞形態(tài)；

3、傳代HSC貼壁伸展生長，約5～7d長滿單層。HSC在SP法染色后，desmin和GFAP陽性率97％以上。毒性實(shí)驗(yàn)表明NF-kBp65 ASODN在0.001～lumol/L濃度對于體外培養(yǎng)傳代大鼠HSC無明顯毒性。TNFα-刺激HSC后NF-kB活性增強(qiáng)，應(yīng)用NF-kBp65 ASODN(0.01～1umol/L)作用后，NF-kB活性明顯減弱，呈劑量依賴性。NF-KBp65 ASODN濃度在0.01umol/L～lumol/L時(shí)抑制

4、HSC的增殖，以濃度為lumol/L抑制作用最明顯，呈劑量依賴性。轉(zhuǎn)染NF-kBp65 ASODN(0.01～1umol/L)明顯減少TNF-α誘導(dǎo)HSC的IL-6mRNA、I型前膠原mRNA表達(dá)和IL-6蛋白、I型膠原蛋白分泌，呈劑量依賴性。 【結(jié)論】NF-kBp65 ASODN在0.001～lumol/L濃度對于體外培養(yǎng)傳代大鼠HSC無明顯毒性，為轉(zhuǎn)染NF-kBp65 ASODN進(jìn)行肝纖維化治療提供可能性。轉(zhuǎn)染NF-KBp6