miR-150抑制肝星狀細胞LX-2激活的機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 微小RNAs(microRNAs，miRNAs)通過與靶基因的3'非翻譯區(qū)(Untranslatedregion，UTR)以堿基互補配對的方式控制基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯進程。近來，越來越多的文獻證實微小RNAs與肝纖維化進程密切相關。有報道顯示miR-150可以通過抑制其已知靶點C-myb的表達進而抑制肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活及減少細胞外基質(zhì)蛋白如Ⅰ型膠原的產(chǎn)生。然而

2、，我們發(fā)現(xiàn)減少的C-myb表達并不能一一對應由miR-150引起的所有現(xiàn)象。我們推測miR-150對HSCs的抑制可能存在其它潛在的分子機制。
　　 目的：
　　 本研究通過構(gòu)建TGF-β1誘導人肝星狀細胞LX-2激活的體外模型，觀測肝纖維化相關的目的miRNA，即miR-150的表達改變;并進一步確證其與TGF-β1刺激是否存在濃度和時間依賴性?；謴蚅X-2中miR-150濃度對LX-2是否存在抑制以及細胞外基質(zhì)的表達

3、改變情況，并最終探討miR-150抑制TGF-β1激活的LX-2的分子機制。
　　 方法：
　　 1.研究模型:采用不同的TGF-β1濃度(0 ng/ml，0.1 ng/ml，0.5 ng/ml和2ng/ml)刺激LX-2，并檢測Col1A1的含量確證肝纖維化體外研究模型的建立。
　　 2.miR-150的確證:采用real-time PCR法檢測不同時間（0h，24h，48h和72h）和不同濃度（0 ng/ml

4、，0.1 ng/ml，0.5 ng/ml和2 ng/ml）TGF-β1刺激下miR-150表達含量的改變。
　　 3.過表達的miR-150對LX-2的影響:分別采用MTT法、ELISA細胞凋亡檢測試劑盒檢測miR-150模擬物（miR-150 mimics）轉(zhuǎn)染后的LX-2細胞的增殖活力和細胞凋亡率;同時，采用real-time PCR和western blot法檢測細胞外基質(zhì)相關蛋白Ⅰ型膠原和α-SMA的mRNA及蛋白表達改

5、變。
　　 4.使用TargetScan Human Release6.2軟件預測miR-150的靶基因，并采用熒光素報告基團實驗確證。
　　 結(jié)果：
　　 1.體外模型的建立:0 ng/ml，0.1 ng/ml，0.5 ng/ml和2 ng/ml不同TGF-β1濃度刺激下LX-2的Col1A1含量成劑量依賴性增加(P＜0.05)。
　　 2.miR-150的確證:當TGF-β1濃度由0 ng/ml增加到

6、2 ng/ml時，miR-150表達含量為濃度依賴性下調(diào)(P＜0.05);當0.1 ng/ml TGF-β1分別作用0h、24h、48h和72h時，miR-150表達含量呈現(xiàn)為時間依賴性下調(diào)（P＜0.05）。
　　 3.過表達miR-150的影響:隨著miR-150含量的恢復，LX-2細胞中Ⅰ型膠原和α-SMA的mRNA及蛋白明顯下降(P＜0.05);與對照組相比，miR-150過表達組的增殖率明顯受到抑制，僅為62.1％(P＜

7、0.05)，但凋亡率卻無任何改變(P＞0.05)。
　　 4.利用TargetScan發(fā)現(xiàn)miR-150種子序列與Col4A4和Sp1 mRNA的3'UTR區(qū)可以互補配對，且物種間的保守性較高;構(gòu)建含待測靶基因Col4A4或Sp1的報告質(zhì)粒后，與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-150前體組中熒光素活性均明顯下調(diào)(P＜0.05)。同時，構(gòu)建含Col4A4或Sp1突變序列的報告質(zhì)粒，與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-150前體組中熒光素活性并無明顯

8、變化(P＞0.05)。
　　 5.與對照組相比，在過表達miR-150的LX-2細胞中Sp1的上游通路分子Smad2，p-Smad2，Smad3和p-Smad3均未有改變。
　　 結(jié)論：
　　 1.miR-150存在明顯的抗纖維化作用，可以減少LX-2細胞的增殖，但不涉及其凋亡的改變。
　　 2.miR-150可以通過其靶點Sp1和Col4A4分別降解Ⅰ型和Ⅳ型膠原含量，而這一過程并未涉及TGF-β/Sm